[发明专利]荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法

权利要求书

1.一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：将含有荭草花提取物的缓冲液加入到处于对数生长期的H9c2心肌细胞中培养，去除溶液，清洗；向清洗后的所述H9c2心肌细胞加入pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇，离心，收集上清液调节pH值为4，上样于Oasis HLB小柱，先用甲酸水清洗小柱，再用甲醇冲洗小柱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥，再加入甲醇溶解，离心分离，取上部的澄清液用于UHPLC-Q-TOF/MS检测分析；

所述荭草花提取物的制备方法包括以下步骤：取荭草花加水煎煮，所得煎煮液浓缩至1.04～1.05，加入乙醇至溶液的含醇量达65％以上，混匀，静置，过滤，所得滤液浓缩至1.04～1.05，然后加入正丁醇萃取，将正丁醇萃取液浓缩，得萃取物；将所述萃取物用乙醇溶解，上样于聚酰胺层析柱，用80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得荭草花提取物。

2.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述煎煮的次数为3次；每次所述煎煮的时间为1小时；每次所述煎煮时，加水的重量为所述荭草花重量的10倍。

3.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述含有荭草花提取物的缓冲液是将荭草花提取物溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过滤，得浓度为2mg/ml的溶液。

4.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述培养的条件为：在37℃、5％CO₂的条件下静置培养1小时；所述清洗采用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液来进行，所述清洗的次数为4次；每次所述清洗的时间为3分钟。

5.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述振摇的温度为37℃；所述振摇的时间为30分钟；所述振摇采用恒温水浴振荡器来进行；所述离心的时间为10分钟，离心的转速为10000r/分钟。

6.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述对数生长期的H9c2心肌细胞的培养方法包括以下步骤：取H9c2心肌细胞1株移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中混合，离心，去除上清液，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养，生长2～3天后细胞达到融合时用胰蛋白酶-EDTA的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养；然后取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6～8×10⁵个/m L接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，选择胞浆饱满、生长状态良好的细胞，备用。

7.根据权利要求6所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述DMEM培养基的配制方法为：每袋培养基先加入600m L三蒸水，加入3.7g Na HCO₃，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/m L的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节PH值为7.0～7.2，采用0.22μm滤器过滤除菌，分装于4℃冰箱保存备用。

8.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述UHPLC-Q-TOF/MS检测分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，流动相：0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈梯度洗脱，梯度洗脱，柱温40℃，流速0.3mL·min^-1，进样量1μL；质谱条件为：电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描，毛细管电压，锥孔电压：80V，离子源温度：110℃，雾化气压力：1.3bar，流速：6.0L/min，温度180℃，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic；数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM。

9.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述甲酸水的浓度为0.1％；所述甲醇溶解的甲醇浓度为50％；所述离心分离的转速为15000r/分钟，所述离心分离的时间为10分钟。