[发明专利]一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒

权利要求书

1.一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，甲基睾酮标准品，水产品中甲基睾酮的抗体冻干品，甲基睾酮的羊抗鼠抗体，洗涤液所组成。

2.一种根据权利要求1所述检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括，免疫原、包被原和单克隆抗体的制备及样本前处理，其特征在于：

（1）采用琥珀酸酐法衍生化制备半抗原MT17，进一步偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)制备免疫原MT17-KLH；

（2）采用活泼酯法将半抗原MT17与载体蛋白KLH和BSA 偶联，反应液置于 0.9%NaCl溶液中，4℃下透析72h，分别制备免疫原MT17-KLH 和包被原MT17-BSA（图 1），偶联物采用紫外扫描光谱进行鉴定；

（3）用 MT17-KLH（1 g/L）免疫新西兰大白兔，每次免疫剂量500 μg（按KLH 量计算），每隔 3 周加强免疫一次，第 5 次免疫9d后心脏取全血，血清经辛酸-硫酸铵法纯化，-20 ℃保存；

（4）将MT标准物用缓冲液配制成系列浓度的标准工作液，优化确定 ic ELISA包被原浓度、抗体稀释度、抗体反应时间和药物稀释液等反应条件；采用Origin Pro 8.0 软件四参数对数函数进行数据分析，绘制竞争标准曲线，其中横坐标为MT 标准液浓度的对数值，纵坐标为 B/ B₀（B为添加竞争药物时的吸光值，B₀为不添加药物时的吸光值），计算获得 icELISA 的最低检测限（LOD），抑制浓度（IC₅₀）、线性检测范围等参数，基于上述的最佳检测条件，建立了甲基睾酮ic ELISA标准曲线（图1），IC₅₀为3.48μg/L，最低检测限为0.31μg/L，定量检测线性范围为0.77~13.06μg/L，满足GB 21981-2008和SC/T 3029-2006的相关检测要求；

特异性分析：选用MT结构类似药物进行ic ELISA测定，以交叉反应（CR）评价方法的特异性，结果按式计算：CR/%=[IC₅₀（MT）/IC₅₀（其它药物）]x100%。

3.（6）样本处理：鱼虾类样品取可食肌肉部分，均质处理成肉糜状的待测试样；称取试样 5.0 g 于50mL 聚苯乙烯离心管中，加入 20mL 乙腈，均质处理 1 min，加入10.0 g无水Na₂SO₄漩涡混合2 min，超声波提取10 min，4000 r/min 离心 5 min 后收集上清液，重复提取一次；净化：上清液减压蒸干，加入2mL 50%甲醇-PBS溶液复溶，取1mL复溶液转入装有40mg PSA的离心管中，充分漩涡震荡 2 min，10000 r/min 离心5 min后吸取上清液测定；

液相色谱-串联质谱分析

液相色谱条件：Waters C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.3mL/min;进样量：10 μL；流动相A 为5mmol/L 乙酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0~3min，80%~10% A；3~5 min，10% A；5~6 min，10%~80% A；6~10 min，80% A；

质谱条件：电喷雾电离正离子模式；喷雾电压：5000V；雾化气：5 L/min；气帘气：8 L/min；离子源温度：500℃；驻留时间：100 ms；母离子：303.2；子离子：97.1（定量）/109.1（定性）；

（8）将步骤（6）的待测物进行酶联免疫，对照标准曲线计算样品中的甲基睾酮的含量。

4.根据权利要求l所述检测甲基睾酮的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。

5.根据权利要求l所述检测甲基睾酮的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：取包被有甲基睾酮的的微孔包被板，加入50μL的甲基睾酮或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL以缓冲液稀释的甲基睾酮抗体，25℃反应0.5小时，用洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的l00μL羊抗兔抗体，25℃反应0.5小时，用洗涤液洗六3次，加底物A、B各50μL，25℃反应15min后终止，测量其吸光度值，从标准曲线计算样品中的甲基睾酮的含量；其特征在于：所述试剂盒还包括A , B , C , D , E , F试剂液、G试剂液、H试剂液、I试剂液、J试剂液、K试剂液、L试剂液和M试剂液。