[发明专利]一种检测水牛乳和羊乳中掺伪牛乳的酶联免疫试剂盒

权利要求书

1.一种检测水牛乳和羊乳中掺伪牛乳的酶联免疫试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，牛IgG标准溶液，抗牛IgG的多克隆和高特异性单克隆抗体，酶标记的羊抗鼠抗体，洗涤液所组成。

2.一种根据权利要求1所述检测水牛乳和羊乳中掺伪牛乳的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被抗体和单克隆抗体的制备及样本前处理，其特征在于：

（1）抗体和抗体标记物的制备：使用牛IgG免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗

体；使用本课题组先前报道的方法制备牛IgG的Fc片段，将其作为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗牛IgG的Fc片段单克隆抗体；抗体制备方法参考文献进行；使用分别包被牛IgG、绵羊IgG、山羊IgG、水牛IgG的ELISA板按间接法对细胞株进行特异性筛选；使用硫酸铵沉淀法纯化抗体；抗体的辣根过氧化物酶标记按课题报道过的抗原结合位点保护标记法进行；（2）单克隆抗体的选择：5株效价较高的阳性细胞株被筛选出，并使用分别包被有1μg/m L黄牛IgG、绵羊IgG、山羊IgG、水牛IgG的ELISA板测试其特异性；表1可知，5株细胞中有3株对绵羊IgG、山羊IgG和水牛IgG产生了不同程度的交叉反应，其中6E7的交叉反应接近100%，说明不同种属具有某些相同的IgG抗原表位；李玲曾采用牛Ig G制备抗体检测水牛的Ig G含量，也从侧面证明了这种交叉反应；因此研究必须通过细胞筛选避免这种交叉反应的发生；表1显示，有2株细胞只对牛IgG产生反应，显示了良好的特异性；效价较高的2D9制备的抗体被用于后续ELISA试验；ELISA试验中抗体的特异性至关重要，目前使用比较多的特异性抗体主要是经过免疫吸附的多克隆抗体和通过随机细胞筛选制备的单克隆抗体；免疫吸附法是一种制备多克隆特异性抗体的常用方法，其将可以发生交叉反应的蛋白固定在活化树脂上，吸附多克隆抗体中可以发生交叉反应的抗体；该方法研发时间短、成本低，但是免疫吸附只能降低交叉反应，并不能消除，仍然不能满足高特异性ELISA的要求；并且如果需要避免和多个抗原的交叉，需进行多次免疫吸吸附，将放大多克隆抗体的批间差异，导致不适用于商品化试剂盒的开发；于是，通过随机细胞筛选制备单克隆抗体，就成了获得稳定且特异抗体的重要途径；课题组曾选用完整的牛IgG作为抗原免疫小鼠制备单抗，但是未获得理想的特异性抗体；其原因在于，完整的IgG具有众多的抗原决定簇；Fab片段主要是抗体的可变区，分布着同种异型和独特型抗原表位，所制备单克隆抗体可能会对同物种来源的样品产生识别差异；而Fc片段为抗体的恒定区，有多个同种型抗原表位，是区分不同种属的重要标示物；因此为了减少Fab片段的干扰，提高随机细胞株筛选的成功率，研究以Fc片段作为抗原制备单抗，分泌特异性抗体细胞株的获得率达到了40%；（3）包被抗体的确定：研究分别对两种反应模式的灵敏度进行了考察：一种是采用抗牛IgG兔多抗作为包被抗体配对酶标抗牛IgG Fc片段单抗作为二抗，另外一种是抗牛IgG Fc片段单抗作为包被抗体配对酶标抗牛IgG兔多抗作为二抗；由图1可知，这两种模式的IC₅₀分别为8.9μg/m L和4.3μg/m L，采用抗第二种反应模式（包被单抗）更为灵敏；单克隆抗体只结合蛋白上的一个表位，而多抗可和蛋白上的多个抗原表位相结合；使用多克隆抗体作为包被抗体将封闭一部分抗原上的单抗识别表位，从而使一部分抗原无法再和作为二抗的单抗相结合；而使用单克隆抗体作为包被抗体则能克服这一缺点，从而获得更高的灵敏度；所以试验采用包被单抗的方式建立ELISA方法；在孵育时间的选择上，延长样品溶液以及二抗的孵育时间能增加抗原抗体的结合量，从而获得更高的灵敏度；但是掺伪检测不同于有害物检测，不需要极低的灵敏度，反而检测时间才是最为宝贵的；所以试验所建立的方法，采用短时间孵育的方式，将ELISA的总孵育时间缩短在50min内完成，灵敏度达到100 ng/m L。

3.根据权利要求l所述检测水牛乳和羊乳中掺伪牛乳的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。