[发明专利]抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于药学科学领域，具体地涉及一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法。

背景技术

玻璃海鞘广泛分布于山东沿海地区，它是发育与进化生物学研究的重要生物，且近年来研究发现它具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、免疫调节以及生物催化等作用，因而引起人们广泛关注。玻璃海鞘具有广泛的应用价值，因此被《Science》杂志称为生物学研究的后起之秀，具有良好的应用前景。

从萨氏海鞘(Cionasavignyi)中分离出的一种新型多肽CS5931具有显著的抗肿瘤活性，N-末端序列分析发现，CS5931与人颗粒体蛋白(granulin，GRN)有同源性。本课题组已成功通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931，其同样具有显著的抗肿瘤活性。为提高海鞘多肽的稳定性和利用率，发挥其抗肿瘤的临床作用，因此发明一种将海鞘多肽制成抗肿瘤的冻干药物制剂具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法。

本发明采用如下技术方案实现：

一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂，其特征在于：所述制剂包括海鞘多肽CS5931和赋形剂。

进一步的，所述赋形剂选自糖类、多元醇类、聚合物类中的一种或几种；所述糖类选自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纤维素中的一种或几种，多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一种或几种，聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明胶、β-环糊精、纤维素中的一种或几种。

更进一步的，所述海鞘多肽CS5931与赋形剂的重量份数1：1～4，优选1：2。

本发明还提供了所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：称取海鞘多肽，加入适量注射用水溶解，加入赋形剂使溶解，补加注射用水至全量，用0.22μm滤膜无菌过滤，灌装，将混合后的溶液装入清洁无菌的西林瓶中，用胶塞半扣塞，冷冻干燥，即得。

进一步的，冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃～-25℃，保温4-5小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温15-17小时；二次干燥：板层温度20～30℃，保温4-5小时以上。

更进一步的，冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃，保温4小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温16小时；二次干燥：板层温度25℃，保温4小时以上。

本发明还提供了所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：将克隆编码多肽CS5931的基因在大肠杆菌中表达，并通过DEAE离子交换和Superdex75分子筛凝胶层析制备目的多肽；经变性复性后，制备好不带His标签的有活性的目的多肽；具体步骤如下：

1)海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)构成工程菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931(简称pET21a-CS5931,下同)，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；

所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃；

2)海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过DEAE阴离子交换柱层析和Superdex75分子筛凝胶层析制备；使目的多肽得到纯化；

3)所述的变性复性：向纯化好的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mML-半胱氨酸，0.3-0.6mML-精氨酸，0.3-0.6mMEDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品浓缩冻干得到纯化后的抗肿瘤海鞘多肽CS5931。