[发明专利]一种自主清除H2O2的酶级联合成松脂素的方法

说明书

本发明公开了一种自主清除H₂O₂的酶级联合成松脂素的方法，属于生物化工领域。本发明使用相对廉价且易于工业化大规模获取的丁香酚为底物，通过酶级联合反应可自主清除松脂素合成过程中产生的H₂O₂，从而解除其对酶活性的抑制作用。此外，本发明方法使用全细胞作为催化剂，细胞可以提供了辅因子再生的环境，从而在反应过程中无需外源添加昂贵的辅因子。本发明松脂素的产量可达到7.12g/L，转化率为61.55％。

技术领域

本发明涉及一种自主清除H₂O₂的酶级联合成松脂素的方法，属于生物化工领域。

背景技术

松脂素是最简单的木酚素之一，属于植物雌激素。松脂素是哺乳动物木酚素肠内酯和肠二醇的前体，后两者产生于近侧结肠，且对动物自身具有重要的生理意义。由于具有其抗氧化、(抗)雌激素特性，这些木酚素可以减少一系列疾病风险，如激素相关的癌症、骨质疏松症及心血管疾病。有研究表明，松脂素能够抑制人类HL60白血病细胞的再生，及诱导该细胞的分化。松脂素对HIV-1的复制具有抑制作用。另外，松脂素还是低血糖、抗黑色素和抗真菌的重要候选化合物。

尽管松脂素可以从亚麻和芝麻的种子中分离得到，但是该过程效率底下且产率很低，例如，每100g新鲜的芝麻种子中仅能分离得到29mg松脂素。另一方面，松脂素的化学合成非常复杂，涉及到许多步单独的化学反应。

虽然已有使用酶催化的方法转化松脂素，然而其选择性和产物浓度均较低，且该方法所使用的底物为价格昂贵的松柏醇。E.Ricklefs等人设计了一种酶级联反应，以丁香酚为底物，通过两步酶催化反应，合成了松脂素1。该级联首先以香草醇氧化酶(Vanillylalcohol oxidase, VAO)将丁香酚转化为松柏醇，再使用漆酶将松柏醇氧化偶合为松脂素。丁香酚是丁香油的主要成分，丁香油可在工业化规模从丁香树Syzygium aromaticum中大规模提取。丁香酚是一种廉价且可以广泛获取的天然底物。然而，该酶级联依然存在两个主要问题。首先，将丁香酚转化为松柏醇的过程需要以氧为电子受体，同时释放出H₂O₂，每转化一分子松脂素即生成一分子H₂O₂，如化学反应式(1)；而H₂O₂的积累对酶的活性有强烈的抑制作用。其次，香草醇氧化酶和过氧化物酶均依赖于辅因子，而E.Ricklefs等设计的酶级联为体外反应，从而为了维持酶活性需要额外添加昂贵的辅因子。

C₁₀H₁₂O₂+O₂+H₂O→C₁₀H₁₂O₃+H₂O₂ (1)

2C₁₀H₁₂O₃+H₂O₂→C₂₀H₂₂O₆+2H₂O (2)

发明内容

基于上述问题，本发明提出了一种使用香草醇氧化酶和过氧化物酶的二步酶级联，以丁香酚为底物，使用过氧化物酶催化松柏醇的氧化偶合生成松脂素，同时自主清除松柏醇合成过程中产生的H₂O₂，如化学反应式(2)。该酶级联系统具有如下优势：(I)以相对廉价且天然的丁香酚作为底物；(II)自主清除合成过程中的H₂O₂，从而解除其对酶的抑制；(III)胞内环境可维持辅因子的再生，从而无需外源添加昂贵的辅因子。