[发明专利]一种自主清除H2O2的酶级联合成松脂素的方法

权利要求书

1.一种自主清除H₂O₂的松脂素高效合成方法，其特征在于，以重组大肠杆菌全细胞作为催化剂，以丁香酚为底物；所述的重组大肠杆菌过量表达香草醇氧化酶PsVAO和过氧化物酶Prx02，所述重组大肠杆菌共表达PsVAO和Prx02，或表达PsVAO和Prx02融合基因，所述的香草醇氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，全细胞转化体系的反应介质为10-200mM的磷酸盐缓冲液，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀＝18±1，底物浓度范围为0.1-5.0％，所述的全细胞转化体系的pH范围为6.0-9.0，反应温度范围为25-42℃。

2.根据权利要求1所述的一种松脂素的生物合成方法，其特征在于，以50mM的磷酸盐缓冲液作为反应介质，全细胞转化体系中重组大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀＝18±1，底物浓度为0.5％，所述的反应体系的pH为7.0，反应温度为25℃。

3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，过量表达来源于简青霉的香草醇氧化酶PsVAO和来源于大肠杆菌BL21(DE3)的过氧化物酶Prx02。

4.根据权利要求3所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.一种构建权利要求3或4所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，主要步骤如下：

(I)PsVAO和Prx02共表达载体的构建：

(1)分别使用酶切位点Bam HI/Hind III将PsVAO和Prx02分别克隆至ePathBrick表达载体pET-28a(PB)，分别得到重组质粒pET-PsVAO和pET-Prx02；

(2)构建PsVAO和Prx02的共表达载体；

(II)PsVAO和Prx02融合基因表达载体的构建：

(1)组装构建重组质粒pUC18-PsVAO-Prx02、pUC18-Prx02-PsVAO；两种基因融合方式均由编码连接肽GGGS的核酸序列连接；

(2)分别使用限制性内切酶Bam HI/Hind III消化pUC18-PsVAO-Prx02、pUC18-Prx02-PsVAO和pET-28a(PB)，将胶回收的融合基因PsVAO-Prx02和Prx02-PsVAO分别连接到pET-28a(PB)上，构建重组表达质粒pFus1和pFus2；

(III)别分将(I)、(II)所述的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到具有松脂素合成能力的重组大肠杆菌。

6.权利要求3或4所述重组大肠杆菌在制备用于治疗人类HL60白血病的药物中的应用。

7.权利要求3或4所述重组大肠杆菌在制备用于治疗HIV-1感染的药物中的应用。