[发明专利]一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法

说明书

本发明公开了一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法，包括细胞培养：取生长良好的传代细胞；传代时细胞的接种密度为20万~40万个/ml，获得接种细胞；制备种毒：取生长良好的传代细胞加入生长液使传代细胞长成单层后弃掉生长液接种基础种毒，冻融后收获得到生产用种毒；制备细胞悬液以及制备病毒液。本发明在现有常规的生产工艺上进行了优化，在单层细胞接种后再加入细胞悬液进行两次细胞培养工艺，能够打破现有生产工艺的瓶颈，有效提高病毒液中病毒的含量和滴度，有效缩短生产周期，提高产品质量，降低生产成本；同时本发明的方法还具有操作简单和重复性好的特点。

技术领域

本发明涉及病毒培养技术领域，具体涉及到一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法。

背景技术

病毒(Virus)由一种核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质(Protein)构成或仅由蛋白质构成(如朊病毒)。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构，由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。但是当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸(基因)侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。

猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Porcinepseudorabies virus,PRV)引起的以发热和脑脊髓炎为主要特征的急性、发热性传染病。该病可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病，具有高致死率。而猪是该病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是该病毒的自然储存库。所以，从猪群中切断伪狂犬病毒的传播是控制伪狂犬病的有效途径。成年猪一般呈隐性感染，引起生长停滞，增重缓慢等；怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊等综合症；7日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率可达20％～40％。

目前，该病分布于全世界50多个国家和地区，我国已有23个省(市)报道了该病的发生，给畜牧业造成了巨大的损失。因此必须对该病进行有效的预防和控制，最根本的措施是疫苗接种，而疫苗效果好坏主要取决于抗原的制备，抗原的制备又大多采用细胞增殖病毒的方法，但由于该病毒在不同的细胞上增 殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养，将难以生产出优质的疫苗的。

转瓶培养细胞是较传统的一种生产工艺，该工艺按照常规的生产方法制备的半成品抗原效价较低，批间差会比较大，生产效率低下，难以达到配苗要求。常规方法的转瓶生产，常在接毒时间、接毒量以及收获时间上进行工艺摸索，找到病毒增殖的一个峰值；但是现有工艺基础上对抗原病毒含量有进一步提升难度是非常大的。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法。

为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步骤：

(1)、细胞培养：取生长良好的传代细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为20万～40万个/ml，获得接种细胞；

(2)、制备种毒：取生长良好的传代细胞加入生长液使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种基础种毒，加入维持液并使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，待细胞病变达到70％～80％时将细胞在低温下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；

(3)、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加入含有血清的维持液振荡待用，得到细胞悬液；

(4)、制备病毒液：取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，然后再加 入细胞悬液后培养，当细胞病变达到70％～80％时停止培养进行冻融处理，收获病毒液。

优选的，述传代细胞为ST细胞或者VERO细胞。