[发明专利]一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法有效
| 申请号： | 201611153492.3 | 申请日： | 2016-12-14 |
| 公开（公告）号： | CN106754749B | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 吴越;万成燕;冯锡良;周俊花;曾衍华;陈树林;黄梅 | 申请（专利权）人： | 四川省华派生物制药有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 51229 成都正华专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李林合;李蕊 |
| 地址： | 641400 四川省资*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 传代细胞 病毒液 种毒 接种 细胞培养工艺 生长液 制备 生产工艺 细胞培养 传代 缩短生产周期 制备细胞悬液 病毒 单层细胞 接种细胞 细胞悬液 常规的 生长 单层 滴度 冻融 瓶颈 细胞 收获 优化 生产 | ||
1.一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步骤：
（1）、细胞培养：取生长良好的传代细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为20万~40万个/ml，获得接种细胞；
（2）、制备种毒：取生长良好的传代细胞加入生长液使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种基础种毒，加入维持液并使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，待细胞病变达到70%~80%时将细胞在低温下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；
（3）、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加入含有血清的维持液振荡待用，得到细胞悬液；
（4）、制备病毒液：取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，然后再加入细胞悬液后培养，当细胞病变达到70%~80%时停止培养进行冻融处理，收获病毒液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述传代细胞为ST细胞或者VERO细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述处理液为0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶的混合液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）细胞培养过程中，接种体积为接种瓶体积的10%。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中基础种毒为猪传染性胃肠炎病毒TGEV或伪狂犬病毒；所述冻融的低温温度为-15℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中加入接种瓶体积30%的维持液，所述维持液中含有2%~8%的血清。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中细胞悬液的加入量为培养瓶体积的10%。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中生产用种毒的接毒量为0.001MOI~0.1MOI。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中培养温度为37℃。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中取生长成单层的接种细胞的具体过程为：接种细胞按照1:3的比例进行传代培养，培养40小时~60小时后细胞生长层致密单层。
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