[发明专利]一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法

说明书

技术领域

本发明属于卵巢细胞分离及体外培养技术领域，具体涉及一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法。

背景技术

迄今为止，国内研究者尝试了龟鳖类动物各种体组织的细胞培养，包括胚胎原代细胞培养、龟的脑和肝脏、脾脏、肾脏及心脏等组织细胞的培养。其中除了心脏组织的纤维细胞培养获得了稳定的细胞系，其它组织细胞的培养基本培养不过10代就出现“自发转化”现象或衰退，进而细胞无法继续传代培养。即使是已获得稳定细胞系的心脏纤维细胞系，相对其它动物细胞系而言，同样是生长缓慢,对温度、传代时间等有较强的依赖性。无法获得生长良好的稳定的龟鳖动物细胞系主要是源于没有开发出适于龟鳖类细胞生长的细胞培养基及培育条件。

龟鳖动物作为传统的滋补品，因为具有极高的药用、营养及观赏价值而被过度开发利用，以致其野生物种资源日益匮乏，甚至濒临灭绝。很多龟鳖动物，如黄喉拟水龟及鼋等其野生自然资源极为有限，已成为濒危保护物种。尽管通过多年努力及经验积累，已经在各种龟鳖类珍稀物种的人工繁育方面取得了突破性进展。然而国内外对这些物种的种质保存、细胞工程育种技术等方面的研究还极为有限，从而严重阻碍了这些物种的增殖放流及资源修复等研究工作的开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，该方法步骤新颖、简洁方便、重复性强，能获得高成活率的中华鳖卵巢细胞系。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，包括以下步骤：

(1)选取性未成熟的雌鳖，经灭菌后取出离体卵巢组织，将离体卵巢组织用磷酸盐缓冲液冲洗破碎后，置于容器中；

(2)采用胶原酶和胰酶对冲洗后的离体卵巢组织先后进行消化处理，然后离心收集细胞；

(3)将收集的细胞置于处理过的细胞培养容器中并加入完全培养基进行培养；

(4)待细胞增殖铺满细胞培养容器底部后，用胰酶消化传代培养或冷冻保存，即获得中华鳖卵巢细胞。

在上述中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法中：

步骤(1)中优先选取性未成熟的1～2冬龄雌鳖。

步骤(1)中灭菌处理时优选采用体积百分含量为60～90％的酒精，更佳为70％。

步骤(2)中所述胶原酶的浓度优选为0.5～2mg/mL，更佳为1mg/mL，所述胶原酶优选购自sigma公司，消化时间优选为20～40min，更佳为30min；所述胰酶的质量百分含量优选为0.01～0.5％，更佳为0.025％，所述胰酶优选购自Invitrogen公司，消化时间优选为20～40min，更佳为20min。

步骤(2)中消化处理完后优选用牛血清终止反应，再离心收集细胞。

步骤(3)中1L完全培养基中优选包括以下用量的成分：高糖DMEM(基础培养基)13～14g、pH值缓冲剂Hepes 4～5g、非必需氨基酸0.01～0.03mM、亚硒酸钠1～2nM、丙酮酸钠1～2mM、2-巯基乙醇200～300μM、抗生素penicillin/streptomycin 50～80μM、胎牛血清100～200mL、生长因子4～6纳克。

本申请发明人经过大量试验研究发现，本发明中的完全培养基比较适合培养鳖细胞。

步骤(3)中所述细胞培养容器优选用质量百分含量为0.1～0.5％的明胶包被处理。

本发明具有如下优点：

(1)本发明中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，步骤新颖、简洁方便、重复性强，能获得高成活率的中华鳖卵巢细胞系；

(2)本发明进行的龟鳖动物细胞培养技术及细胞系的建立，适于龟鳖动物细胞培养及稳定传代的培养基与培养条件；

(3)本发明进行的中华鳖卵巢细胞的培养不仅为龟鳖类性别决定机制研究提供不可或缺的体外研究体系，更为重要的是为研究龟鳖动物生殖生理等提供了很好的体外研究平台，为进一步进行龟鳖动物繁育新技术的研究提供了研究基础及平台。

附图说明

图1是实施例1-3中中华鳖卵巢细胞分离及培养流程图；

图2是实施例1-3中体外传代培养的中华鳖卵巢细胞；

图3是实施例1-3中体外培养细胞的染色体分析；

图4是实施例1-3中体外培养细胞的基因表达验证。

具体实施方式

下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

如图1所示，本实施例提供的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，包括以下步骤：