[发明专利]一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法

权利要求书

1.一种中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是包括以下步骤：

(1)选取性未成熟的雌鳖，经灭菌后取出离体卵巢组织，将离体卵巢组织用磷酸盐缓冲液冲洗破碎后，置于容器中；

(2)采用胶原酶和胰酶对冲洗后的离体卵巢组织先后进行消化处理，然后离心收集细胞；

(3)将收集的细胞置于处理过的细胞培养容器中并加入完全培养基进行培养；

(4)待细胞增殖铺满细胞培养容器底部后，用胰酶消化传代培养或冷冻保存，即获得中华鳖卵巢细胞。

2.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(1)中选取性未成熟的1～2冬龄雌鳖。

3.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(1)中灭菌处理时采用体积百分含量为60～90％的酒精。

4.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(2)中所述胶原酶的浓度为0.5～2mg/mL，所述胶原酶购自sigma公司，消化时间为20～40min；所述胰酶的质量百分含量为0.01～0.5％，所述胰酶购自Invitrogen公司，消化时间为20～40min。

5.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(2)中消化处理完后用牛血清终止反应，再离心收集细胞。

6.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(3)中1L完全培养基中包括以下用量的成分：高糖DMEM 13～14g、pH值缓冲剂Hepes 4～5g、非必需氨基酸0.01～0.05mM、亚硒酸钠1～2nM、丙酮酸钠1～2mM、2-巯基乙醇200～300μM、抗生素penicillin/streptomycin 50～80μM、胎牛血清100～200mL、生长因子4～6纳克。

7.根据权利要求1所述的中华鳖卵巢细胞分离及体外培养方法，其特征是：步骤(3)中所述细胞培养容器用质量百分含量为0.1～0.5％的明胶包被处理。