[发明专利]利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法

说明书

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种利用组培苗叶片再生不定芽途径快速繁育羊踯躅的方法；本发明以羊踯躅无菌组培苗顶生第三到第五个叶片做为外植体，对叶片垂直于主脉切割一刀并去除叶柄和叶稍，接种在附加激素TDZ 1.0 mg/L和IAA 1.0 mg/L的WPM培养基上，暗培养10‑15天后进行光照培养，光照培养35天时叶片不定芽诱导率达85%以上，不定芽诱导数平均为7.2个/叶片。在添加ZT 1.0 mg/L和IBA 0.1‑0.5 mg/L的WPM培养基上不定芽生长形成幼苗，幼苗在附加IBA 10‑12.5 mg/L和NAA 0.1mg/L的1/2 WPM培养基上发育成具有根、茎、叶的完整小植株，成株率达95%以上；本方法适用于羊踯躅试管苗工厂化生产及农杆菌介导的遗传转化体系的建立。

技术领域

本发明涉及一种利用组培苗叶片再生不定芽途径快速繁育羊踯躅的方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

羊踯躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)，又名闹羊花、黄杜鹃、黄色映山红，隶属于杜鹃花科杜鹃花属羊踯躅亚属落叶灌木，是中国羊踯躅亚属中仅有的一个原生种。羊踯躅是有待开发的优良的园林绿化树种，可引种驯化成为露地栽培的园艺观赏植物，是杜鹃花色品种改良的重要资源。同时它也是珍稀濒危药用植物，全株器官均含有多种活性成分，花、根、果实等均可供药用，具有祛湿、除风、解痛等功效，可用于治疗风湿、顽癣和疼痛等症；对农作物虫害的防治也有一定的作用，是开发绿色农药的植物源。羊踯躅主要是通过种子、扦插等方式繁殖。然而羊踯躅种子细小难采集，且种子萌发率较低，种子苗生长缓慢，距开花结果的时间较长；以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率极低等问题，使其开发及利用受到极大限制。因此，亟待采取有效的方法对羊踯躅加以繁殖，使之能够规模化生产，满足人们日益增长的需求。

利用植物组织培养技术繁殖羊踯躅可以不受季节和环境条件等因素的影响，并能得到大规模整齐的瓶苗，且繁殖系数高，是解决上述难题的重要途径。国内羊踯躅组织培养快繁技术研究是通过剪取羊踯躅的枝条获得无菌组培苗，进一步通过剪取组培苗的茎节，诱导和培养嫩茎段腋芽丛生的方式建立羊踯躅离体培养和植株再生体系，芽丛的增殖率为4-5倍以上(顾宏辉,袁群英,朱春艳,朱丹华.羊踯躅的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2006,42(4):683；顾地周,陆爽,巴春影,李媛媛.羊踯躅嫩茎离体培养和植株再生[J].山东农业大学学报(自然科学版),2010,43(4):574-578)；以诱导和培养嫩茎段腋芽丛生的方式建立的快繁体系不能作为农杆菌介导的遗传转化体系对羊踯躅进行遗传改良。

发明内容

针对上述问题，本申请以羊踯躅组培苗顶生第三至第五个叶片为外植体材料，通过筛选不同的叶片切割方式、暗培养时间及细胞分裂素和生长素组合，提高叶片不定芽的诱导率和不定芽数目，建立高频率植株再生技术体系，本发明是这样实现的：

一种利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法，其具体步骤如下：

A)在超净工作台上剪取羊踯躅无菌组培苗顶生第三到第五个叶片(该叶片不太老也不太嫩，成熟度适中))，对叶片垂直于主脉切割一刀并去除叶柄和叶稍；

B)将叶片置于不定芽诱导培养基上，暗培养10-15天后进行光照培养，同时观察叶片，可发现光照培养13-16天左右，切口处开始出现不定芽；

C)光照培养35天后，将带不定芽的叶片转到不定芽生长培养基上进行继代培养，30d后形成幼苗；

D)将幼苗切下，转移到成苗和生根培养基上，进行成苗和生根培养，30d后，幼苗即发育成具有根、茎和叶的完整再生植株。