[发明专利]对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法

说明书

发明属于生物检测领域，提供一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测4中曲霉菌并同步进行基因分型的方法，该检测方法包括1）提取待检测样品及4种标准菌株中的DNA；2）制备阳性质粒标准品；3）运行荧光定量PCR；4）数据分析。本发明还提供一种烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒，该试剂盒包括标记有荧光报告基团的上游引物、淬灭基团标记的上游引物互补链及下游引物，它们的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑3所示。是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real‑time PCR技术，具有临床应用价值，可望产生良好的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地说，是一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测曲霉菌并同步进行基因分型的方法。

背景技术

曲霉菌包括132个种和18个变种，占空气中真菌的12％左右，是通过空气传播的常见霉菌，早在1848年就被视为感染根源，不仅会影响人和动物的健康，，还会给农业生产带来巨大的损失。

近年来，随着在器官、骨髓和造血干细胞移植，HIV，肿瘤放化疗等所导致的免疫力低下患者增多，条件致病菌——曲霉菌引起的侵袭性真菌感染逐年升高，临床上最常见的是烟曲霉(A.fumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，土曲霉，黑曲霉(A.niger)，杂色曲霉(A.versicolor)，等，其中黄曲霉的致病率占90％。

虽然已有大量的抗真菌药物上市，但缺乏早期的快速准确的检测曲霉菌的实验室方法，致使临床曲霉病的病死率居高不下(30％)，若未及时治疗，病死率可达90％以上。而临床上对曲霉菌病的治疗费用昂贵，许多患者会放弃治疗。故一种早期快速准确的诊断曲霉菌的实验室诊断方法，可以有效降低曲霉病病死率和医疗负担。

传统的曲霉菌检测方法有培养法、影像学检查、组织病理学检查等方法，如大部分实验室需要根据真菌的菌落表现特征以及显微镜下特征性的分子孢子头和足细胞来鉴定，过程需要7～14天。传统的检测方法存在检测时间长，阳性率低等缺陷。另外也有一些非传统的检测方法，如乳胶凝集法、半乳甘露聚糖法等，乳胶凝集法存在检测敏感度低及假阳性率高等问题；众多学者对半乳甘露聚糖法的特异性和灵敏性高低存在争论。随着技术的发展，PCR方法进入到临床检测领域，特别是实时荧光定量PCR(real-time polymerase chainreaction，real-time PCR)技术的应用，不仅可以早期准确检测，还可以进行定量和分型检测。

Real-time PCR分为内掺式染料技术和探针技术两类。内掺式染料技术采用的染料一般为溴化乙啶、YO-PRO 1和SYBR Green。其原理是利用游离DNA染料不发射荧光，而与双链DNA结合后，荧光值大大增强，从而进行DNA定量。并且还可通过荧光信号监测产物解链温度差异，进行熔解曲线分析，根据不同DNA产物会产生不同的熔解曲线，而实现基因分型。其优势在于能够监测任何双链DNA，只需设计普通引物，使检测方法简化，成本低。但也正是由于染料能够与任何双链DNA结合，因此其也能和非特异性产物如引物二聚体、非特异扩增产物、双链模板等结合，产生非特异荧光信号，降低了特异性，故不适于临床检测。