[发明专利]对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法

权利要求书

1.一种基于二聚体突变荧光引物的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌进行同步定量和基因分型的非诊断性实时PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）生物信息学分析寻找适合曲霉菌同步定量和分型的序列设计一对引物和互补链序列：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'，

下游引物：5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'，

上游引物互补链：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'，互补链中从5’端起第12个碱基是人为设计的碱基突变，使上游引物和互补链不完全匹配；

（2）真菌培养和DNA提取

从广东省菌种保存中心购买曲霉菌的标准菌株：烟曲霉菌ATCC 36607，黑曲霉ATCC16888, 黄曲霉ATCC 16883和土曲霉ATCC 16792，沙堡弱培养基培养后，用真菌DNA提取试剂盒提取标准菌株及待测样品DNA；

（3）构建定量的标准质粒

用普通PCR法扩增黑曲霉菌的分型和定量序列，纯化DNA，pMD-18T质粒TA克隆，转化大肠埃希菌DH5α，测序鉴定后，对阳性克隆菌进行增菌繁殖，纯化获取大量重组质粒作为DNA模板，为real-time PCR方法的建立提供可靠的DNA标准品；

上游引物序列：5' -CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'；

下游引物序列：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'；

（4）Real-time PCR体系和循环参数

扩增体系为：PCR-mix buffer，10µL；分别含有2.0µM的上述三条引物，

1.5µL；靶DNA，4.0µL；双蒸水，4.5µL；总体积为20µL；

循环条件为：95°C 5min；95°C 15s，58°C 60s，40个循环；

所述靶DNA为标准菌株或待测样品DNA；所述上述三条引物是步骤（1）中的上下游引物及上游引物互补链；

（5）绘制标准曲线和建立曲霉菌real-time PCR分子分型的标准熔解曲线图谱

绘制标准曲线：标准质粒10倍倍比稀释成10⁷-10¹copies/ml浓度梯度，计算机自动绘制标准曲线；

标准熔解曲线图谱的建立：定量检测扩增完成后，进行熔解曲线分析；同时对4种标准菌株的检测进行熔解曲线分析，获取它们自身特异的熔解曲线图谱，建立真菌分型的标准熔解曲线图谱，黑曲霉，黄曲霉，烟曲霉，土曲霉的解链温度分别为：82.42℃，83.90℃，84.35℃，85.81℃；

（6）基因分型结果判定

PCR循环扩增产物后，不同曲霉菌DNA序列的熔解温度不同，示踪的荧光基团解离后，荧光值发生改变，从而4种不同曲霉菌的DNA序列会得到不同的荧光曲线。

2.一种基于权利要求1的方法对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌进行同步定量和基因分型的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增适合曲霉菌定量和分型的引物，其中引物的序列是：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'，

下游引物：5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'，

上游引物互补链：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'，互补链中从5’端起第12个碱基是人为设计的碱基突变，使上游引物和互补链不完全匹配。

3.如权利要求2所述的试剂盒在制备用于对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌进行检测和基因分型的产品中的应用。