[发明专利]一种重组菌催化莱鲍迪甙A制备莱鲍迪甙M2的方法

说明书

本发明公开了一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙M2中的应用，所述重组菌中同时含有番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因，将番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet‑1的NdeI与XhoI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet‑SL2，然后再将马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet‑SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet‑SL2‑SUS1，将重组质粒pRSFDuet‑SL2‑SUS1转化到宿主细胞中，得到重组菌。将重组菌诱导表达后取粗酶液，加入到反应混合物中催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙M2，反应中使用重组菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分离纯化，也无需制作冻干粉，反应液中不需添加直接底物莱鲍迪甙D及UDP或UDP‑葡萄糖和任何细胞通透剂或其他化学试剂，环境友好性更佳。莱鲍迪甙M2的产率高达11.09g/L。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组菌催化莱鲍迪甙A制备莱鲍迪甙M2的方法。

背景技术

甜菊糖提取自原产于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜叶菊，具有高甜度（为蔗糖的250～300倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特性，食用安全，有一定的药理作用和辅助疗效。它是继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。1998年，美国食品和药物管理局（FDA）同意将甜菊糖添加到食品饮料中。瑞士将甜菊糖列入本国药典作为糖浆剂、口服液或含片的主要甜味剂原料,取代了糖精钠等传统药用甜味剂。相对于日本、美国和瑞士，欧盟批准使用甜菊糖的时间稍晚一些。2008年欧盟正式批准其作为食品添加剂。

由于对甜菊糖的需求量不断增加，许多国家包括日本、新加坡、马来西亚、韩国、中国、以色列、印度、巴西和澳大利亚等都已在商业化种植甜叶菊。甜叶菊的叶子含有多种天然的甜味糖甙如甜菊甙、莱鲍迪A-F、杜尔可甙A和甜茶甙。2008年，美国FDA签发了确认莱鲍迪甙A能以最低95%的纯度用作零卡路里甜味剂的“通常认为是安全的”（“GRAS”）通知。2014年，莱鲍迪甙M也获得了FDA “GRAS”认证。莱鲍迪甙M与莱鲍迪甙A结构相似，只相差两个葡萄糖基，与莱鲍迪甙A相比更具口感优势。莱鲍迪甙M不是甜菊糖总甙中的主要糖甙，但目前已有化学合成（专利201410314371.7和201410553617.6）和生物制备方法（专利201310353500.9和CN201410019981.4）可用于生产莱鲍迪甙M。莱鲍迪甙M2是莱鲍迪甙M的同分异构体,两者结构式如下式所示：

莱鲍迪甙M 莱鲍迪甙M2

莱鲍迪甙M2具有潜在的经济价值。番茄来源的UDP-糖基转移酶UGTSL2能催化莱鲍迪甙A糖基化生成莱鲍迪甙D和莱鲍迪甙M2（US2014/0357588A1,Biomolecules 2014,4:374-389)，莱鲍迪甙D和莱鲍迪甙M2分别占23.7%和6%。其中莱鲍迪甙M2含量低，难以实现大量制备和工业化。

此外，已报道的莱鲍迪甙M的生物制备方法（专利CN201310353500.9和CN201410019981.4），使用重组细胞作为催化剂，需要添加甲苯或其它细胞通透剂；或使用重组细胞冻干粉作为催化剂，而冻干粉的制备耗能、成本高；并且需要额外添加UDP作为UDP-葡萄糖再生体系的辅底物；或需要调配UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶的添加比例，重组菌用量大，产酶成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙M2中的应用，构建的重组菌可以共表达番茄来源的UDP-糖基转移酶UGTSL2和马铃薯来源的蔗糖合酶StSUS1，不需要分开表达和制备、也不需要调节两种酶之间的配比，应用于合成莱鲍迪甙M2过程中直接使用重组菌破碎后的粗酶液，不需添加UDP或UDP-葡萄糖，也不需要使用直接底物莱鲍迪甙D，以及细胞通透剂或其他化学试剂，简化了工艺过程，收率高。