[发明专利]用于检测羧肽酶Y的半菁类荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及羧肽酶Y的检测领域，具体涉及用于检测羧肽酶Y的半菁类荧光探针及其制备方法和应用。公开了半菁类荧光探针及其制备方法，该半菁类荧光探针具有式(1)的结构，其中以特戊基作为羧肽酶Y的识别基团；其合成方法包括：在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)化合物与特戊酰氯接触。本发明还公开了该探针在检测羧肽酶Y的活性中的应用及检测羧肽酶Y活性的方法和检测试剂盒。本发明的半菁类荧光探针用于与羧肽酶Y活性检测有关的应用时，灵敏度高、选择性好、荧光强度的变化大易于检测，稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。

技术领域

本发明涉及羧肽酶Y的检测领域，具体地，涉及一种半菁类荧光探针，该半菁类荧光探针的制备方法和在检测羧肽酶Y的活性中的应用，以及一种羧肽酶Y活性的检测方法和羧肽酶Y活性的检测试剂盒。

背景技术

羧肽酶Y(EC号：3.4.16.1)，可水解所有具有羧基末端的氨基酸，已成为蛋白多肽链C末端分析中的常用工具酶。此外羧肽酶Y还可通过转肽反应使其它氨基酸衍生物或亲核物质取代肽链末端的氨基酸残基，从而形成新肽。

目前测定羧肽酶Y活性的主要方法有紫外吸收光谱法和荧光分光光谱法。有紫外吸收光谱法所需要的底物结构简单，操作方便，目前已经获得广泛使用，但是紫外方法存在以下两方面的缺陷：首先，紫外吸收光谱法的背景干扰大导致分析的灵敏度低；其次，用于分析的底物多为肽类，该类底物合成难度大，成本较高。荧光分光光谱法主要以多肽类荧光探针为底物，反应灵敏度高于紫外分光光谱法，但用于分析的多肽底物合成难度大，成本高，且在常规条件下大都稳定性差，存储和允许条件苛刻，原子利用率低。此外，以三甲基乙酸对硝基苯酯底物可以不用多肽底物，但是以三甲基乙酸对硝基苯酯底物的检测是紫外可见方法，灵敏度非常有限。

目前国内外还没有非肽类近红外荧光探针用于检测羧肽酶Y的活性的报道。因此，设计开发基于非肽类近红外荧光探针来提高检测羧肽酶Y的灵敏度和选择性是非常迫切和需要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有羧肽酶Y活性检测技术中存在的缺陷，本发明提供了一种高选择性、高灵敏度、性质稳定、操作简便、易于储运且成本低廉的非肽底物型羧肽酶Y活性检测荧光探针及其制备方法和应用。

为达到上述目的，第一方面，本发明提供了一种半菁类荧光探针，该半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构；

第二方面，本发明还提供了如上所述的半菁类探针的制备方法，该方法包括：在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示结构化合物与特戊酰氯中接触反应；

第三方面，本发明还提供了如上所述的半菁类荧光探针在检测羧肽酶Y的活性中的应用。

第四方面，本发明还提供了检测羧肽酶Y活性的方法，其中，该方法包括：

将待测样品与如上所述的半菁类荧光探针接触，使得待测样品中的羧肽酶Y被所述半菁类荧光探针中的特戊基所识别，得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度随时间的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中羧肽酶Y的活性；所述激发光的波长为500-680nm，所述荧光的发射波长为690-740nm。

第五方面，本发明还提供了一种羧肽酶Y活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：如上所述的半菁类荧光探针、羧肽酶Y标准品以及反应缓冲液。

本发明的半菁类荧光探针在用于检测羧肽酶Y活性时，探针与羧肽酶Y具有更高的亲和力和更高的选择性，检测灵敏度更高。

本发明提供的半菁类荧光探针荧光探针，在用于检测羧肽酶Y的活性时，与采用多肽类荧光探针相比，具有更高的灵敏度和选择性；且合成的方法简单快速，荧光背景值低。