[发明专利]一种携带Pim-1基因的腺相关病毒2及其在修复受损视神经中的应用

权利要求书

1.一种携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体，其特征在于，所述的腺相关病毒2载体携带如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因的DNA；所述的腺相关病毒2载体选用AAV三质粒系统，由AAV载体pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper组成；目的基因Pim-1由CAGMINI启动子启动；Pim-1基因插入载体MCS多克隆酶切位点，Pim-1的C端带3×Flag标签蛋白。

2.一种如权利要求1所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体的克隆构建设计并合成PCR引物如下：Pim-1-正向引物如SEQ ID NO:2所示；Pim-1-反向引物中SEQ ID NO:3所示；

使用PCR方法从含有如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因cDNA克隆模板进行Pim-1目的基因扩增；将pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物均使用Nhel酶切载体，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和Pim-1基因PCR产物进行连接反应，通过连接反应将上述酶切片段准确连接到pAOV表达载体的NheI位点上，获得pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG表达载体，得到连接产物后，将产物转化到感受态大肠杆菌中，对生长出的转化子进行Pim-1基因腺相关病毒2质粒的克隆鉴定，电泳结果阳性的为阳性克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对PCR鉴定阳性的克隆进行生物测序和分析比对，若序列与数据库中的GenBank ID: NM_017034序列相一致，比对正确，说明质粒构建成功；将构建好的带有荧光蛋白eGFP表达质粒通过超纯去内毒素试剂盒抽提，通过转染试剂lipo2000转染293T细胞，24小时后通过荧光显微镜观察到细胞被转染为绿色荧光，即为Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体转染表达成功；

B）Pim-1基因的重组腺相关病毒2包装

腺相关病毒包装系统采用三质粒系统，将包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper，与Pim-1基因的重组腺相关病毒2表达质粒pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG通过转染试剂lipo2000共转染293T细胞，转染前，AAV-293细胞融合度需达到80%以上，转染72h后，将细胞离心收集，然后将细胞裂解，4℃ 53,000rmp高速离心30h后，收集富含重组腺相关病毒2颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的重组腺相关病毒2的浓缩液，在浓缩液中加入甘油，终浓度为5%，分装后，-80℃保存，最后使用定量PCR测定病毒滴度。

3.一种如权利要求1所述的携带Pim-1基因的重组腺相关病毒2载体在制备治疗修复受损视神经药物中的应用。