[发明专利]一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用

说明书

本发明公开了一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用，属于酶工程领域。本发明将来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶基因maiA通过半理性设计的方法进行了热稳定改造，得到的突变体与野生型的马来酸顺反异构酶相比，突变体G27A‑G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突变体G27A‑K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。

技术领域

本发明涉及一种马来酸顺反异构酶的热稳定性改造及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

马来酸顺反异构酶催化马来酸转化为富马酸，而富马酸又可以经过天冬氨酸酶转化为附加值更高的天冬氨酸或经过富马酸酶转化为苹果酸，要想实现从马来酸向天冬氨酸或苹果酸的直接转化而省去中间产物富马酸的分离纯化，就需要将马来酸顺反异构酶与天冬氨酸酶或富马酸酶耦联起来使用。而不管是天冬氨酸酶还是富马酸酶其热稳定性都要高于马来酸顺反异构酶，要想实现这个耦联催化体系的可连续性和重复使用性，就要求马来酸顺反异构酶有较好的活性和热稳定性。粘质沙雷氏菌来源的马来酸顺反异构酶是现有报道中活性最高的马来酸顺反异构酶，而所有菌株来源的马来酸顺反异构酶的热稳定性都较差。

目前关于提高马来酸顺反异构酶热稳定性的研究还很少。酶活性中心的改造往往会造成酶活性的下降或丧失。

发明内容

本发明首先提供了马来酸顺反异构酶突变体，是将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第171位甘氨酸突变为丙氨酸；或者将第27位甘氨酸突变为丙氨酸并将第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者第27位甘氨酸突变为丙氨酸；或者第104位赖氨酸突变为精氨酸；或者将第171位甘氨酸突变为丙氨酸。

本发明还提供了一种表达所述马来酸顺反异构酶突变体的重组菌，是以pET-24a(+)为表达载体，将编码突变体的基因与表达载体连接后，转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明选取马来酸顺反异构酶的酶分子表面非保守的Gly或Lys，分别突变成Ala或Arg，获得了热稳定性和酶活性提高了的MaiA突变酶，然后将这些点进行组合突变，获得效果更好的突变体。其中，突变体G27A-G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突变体G27A-K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。本发明提供的马来酸顺反异构酶突变体及相应的重组菌，将在富马酸、天冬氨酸或苹果酸的生产中，发挥更好的作用。

附图说明

图1pET-24a(+)-maiA定点突变全质粒PCR结果；M：DNA marker；1：pET-24a(+)-maiA定点突变全质粒PCR结果

图2马来酸顺反异构酶的纯化结果；M：protein marker；1：重组菌粗酶液；2：纯化后的马来酸顺反异构酶

图3野生型和突变体的初始相对酶活和在55℃下的半衰期；(A)单突变体的相对酶活：(B)单突变体55℃半衰期；(C)组合突变体的相对酶活；(D)组合突变体55℃半衰期

图4突变体热稳定性比较

具体实施方式

酶活的测定方法：

反应体系为50μL 1.5mg/mL的纯化后的马来酸顺反异构酶加100μL 1mol/L的马来酸钾溶液再加350μL的pH8.0的磷酸盐缓冲液组成的500μL的反应体系。在40℃反应10min，然后迅速在100℃煮沸10min，离心取上清液稀释50倍，测定生成的富马酸含量。

底物马来酸和产物富马酸互为异构体，用高效液相色谱发(HPLC)进行测定：