[发明专利]西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法

说明书

本发明为一种西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法，属于植物栽培领域种苗技术，具体的讲是利用西伯利亚杏成熟胚诱导体细胞胚胎发生的方法。本发明采用完全成熟的西伯利亚杏种子，取成熟胚为外植体材料，接种到愈伤诱导培养基上培养，诱导产生胚性愈伤，将上述愈伤增殖从而能达到扩繁目的，再由胚性愈伤进行进一步诱导,使其分化形成上期原胚，由早期原胚在一定条件下同步化培养，促使其发育同步化，已同步化培养的早期原胚进一步成熟，形成具备可正常萌发条件的体细胞胚：本发明的优点是，采用本发明获得了大量的西伯利亚杏体细胞胚，实现西伯利亚杏优良品种的快速繁殖。

技术领域

本发明属于植物栽培领域，具体的讲，涉及西伯利亚杏体细胞胚胎发生的一种方法。

背景技术

西伯利亚杏（Armeniaca sibirica (L.) Lam）主要分布于我国北方地区，是我国北方地区的主要经济树种和生态绿化树种，具有广泛应用和实际价值。西伯利亚杏繁殖常用方法主要是播种繁殖和嫁接方法,嫁接方法繁殖能够保持品种的优良特性,遗传性状稳定,但通过嫁接繁殖速度慢,严重阻碍了优良品种在大批量生产的推广应用。播种繁殖需要通过层积等技术，种子处理时间长，要求高，且由于种子产量往往受到气候影响，限制了西伯利亚杏播种苗培养。利用植物体细胞胚胎发生方式能用较少的材料,在较短时间内大量繁殖出统一优良性状的西伯利亚杏苗木。应用体胚发生技术繁殖苗木,其不受地区、气候等影响,扩繁速度比常规方法快数万倍，广泛应用到多种植物上。但迄今为止,西伯利亚杏组培苗在生产尚未应用，对西伯利亚杏体胚发生的研究未见报道。王鸿、马锋旺以西伯利亚杏下胚轴、子叶、茎尖和无性系叶片作为外植体,研究培养试管苗不同外植体、外源植物生长调节剂、培养基类型、培养时间、接种方式等因素对增殖效率、愈伤组织诱导率、再生频率和试管苗生根的影响。刘小蕾、刘艳萌、张学英等通过对西伯利亚杏的茎尖、叶片和下胚轴组织培养初步建立了西伯利亚杏再生体系。本文以西伯利亚杏成熟胚为外植体，经愈伤组织途径诱导胚性愈伤、胚性愈伤组织继代增殖、体细胞胚胎的分化与同步化，以及体细胞胚的成熟与萌发，从而建立西伯利亚杏体胚发生体系，为西伯利亚杏快速繁殖、种质资源保护等提供参考，为西伯利亚杏人工种子的开发应用奠定基础。

发明内容

本发明目的为了解决运用体细胞胚胎发生技术实现西伯利亚杏快繁问题，以西伯利亚杏成熟胚为外植体，以B5、WPM等基本培养基附加不同浓度的6-BA、2,4-D、KT、NAA、ABA以及有机附加物等来诱导胚性愈伤组织、胚性愈伤组织增殖、体细胞胚胎分化与同步化、以及体胚成熟与植株再生，并提供一种诱导、继代及成苗时的方法及培养条件，以实现植株再生与快繁。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

本发明包括以下生产步骤：

（1）将成熟的西伯利亚杏种子用刷子刷去表面残渣，以3%高锰酸钾溶液浸泡12小时后，自来水冲洗3遍，在干净的环境下破壳，取出西伯利亚杏种仁。在超净工作台中，先用无菌水将种仁冲洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸钠溶液消毒3 min,然后用无菌水冲洗3-5次；

（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行诱导培养35天生成愈伤组织；

（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：B5培养基+NAA（0.5mg/L）+KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 还原型谷胱甘肽（100mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行继代培养30天诱导产生胚性愈伤组织；