[发明专利]西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法

权利要求书

1.一种西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将成熟的西伯利亚杏种子用刷子刷去表面残渣，以3%高锰酸钾溶液浸泡12小时后，自来水冲洗3遍，在干净的环境下破壳，取出西伯利亚杏种仁。在超净工作台中，先用无菌水将种仁冲洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸钠溶液消毒3min,然后用无菌水冲洗3-5次；

（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA0.3mg/L+2,4-D0.9mg/L+KT0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行诱导培养35天生成愈伤组织；

（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：B5培养基+NAA0.5mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖20g/L+ 还原型谷胱甘肽100mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行继代培养30天诱导产生胚性愈伤组织；

（4）将步骤（3）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+NAA0.2mg/L +蔗糖20g/L+水解乳蛋白500mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔30天以相同配方继代培养进行增殖；

（5）将步骤（4）所述的增殖得到的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖20g/L+水解酪蛋白800mg/L+谷氨酰胺200mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行分化培养30天；

（6）将步骤（5）所述的分化培养得到的上期原胚接种于下列培养基中：B5培养基+ABA1.5mg/L+蔗糖55g/L+水解酪蛋白800mg/L+谷氨酰胺200mg/L+肌醇500mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下同步化培养15天，使上期胚胎发生发育达到同步化，得到同步化体细胞胚 ；

（7）将步骤（6）所述的同步化体细胞胚接种于B5培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下培养20天后，体胚发育成熟，达到萌发的指标，得到分化成熟体细胞胚；

（8）将步骤（7）所述的分化成熟体细胞胚接种于1/2WPM培养基+蔗糖20g/L+琼脂6g/L,pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、3000Lx光照条件下培养30天后即可长成根茎叶健全的健壮西伯利亚杏幼苗。