[发明专利]一种耐热酯酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种耐热酯酶突变体及其制备方法和应用，该突变体是对野生型耐热酯酶进行突变获得的，野生型耐热酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述突变发生的位点包括如下至少一个突变位点：所述突变发生的位点为第89位氨基酸由L突变为R，第20位氨基酸由F突变为A，第33位氨基酸由F突变为A，第40位的氨基酸由L突变为A，第213位氨基酸由L突变为A，第289位氨基酸由F突变为A，其中第89位为必要突变位点。本发明利用酯酶催化甘油酯进行环氧化反应，环氧化能力明显高于野生型，没有副反应发生，环氧脂肪酸甘油酯的得率高、成分单一、易于分离回收，生产过程可控性强，具有经济性和环保性。

技术领域

本发明属于生物技术和酶工程领域，涉及一种耐热酯酶突变体制备方法和应用。

背景技术

在聚合物材料中添加增强其塑性的物质称为增塑剂，亦称塑化剂或可塑剂，是塑料制品加工中不可缺少的加工助剂。但长期以来，国际环境保护部门研究发现，以邻苯二甲酸二辛酯(DOP)等邻苯类产品为主的塑化剂，容易引发组织发生癌变，扰乱内分泌，因此，国际上普遍对其采取相应的限制使用措施。

目前，我国生产无毒、环保的非邻苯类增塑剂品种相对匮乏，相关应用更少。大量的研究表明，环氧化油脂及其衍生物可作为增塑剂代替DOP的使用。传统的环氧化物的生产一般是通过化学法进行，化学工艺生产环氧化物需要消耗大量的能量和水资源，也会导致大量“三废”的产生。目前已经有越来越多的研究尝试利用生物化工技术实现环氧化过程。酶法催化环氧化因其具有高选择性、专一性、高收率，而且能最大限度地降低开环等副反应发生的优势而备受关注。现有的酶催化方法中，使用最多的催化剂为脂肪酶，溶剂为甲苯、二甲苯和正己烷等有机溶剂。众所周知，脂肪酶可以水解甘油酯生成游离脂肪酸，因此利用脂肪酶催化脂类进行环氧化时，会伴随有脂类物质自身和产物环氧化甘油酯被脂肪酶水解产生脂肪酸的副反应发生。如需要得到低酸价的环氧化物，需要对环氧化反应产物进行脱酸处理，导致延长工艺流程，增加生产成本。酯酶作为一种特殊的酰基水解酶，一般只水解短链的酰基甘油酯，广泛用于食品加工、生物医药、日用化工以及造纸等领域。在过氧化氢或过氧酸存在下，酯酶具有良好氧化酶活性，所以利用酯酶以上特性，将其应用于酶法制备环氧大豆油、脂肪酸甲酯和不饱和烯烃类的生产中，不仅可以解决酶法制备水解副反应的发生，还可以获得高纯度的产品，提高环氧化物增塑剂的品质。

蛋白质工程是一种能够改善蛋白质特性的方法，该方法在生物医药，生物催化等领域得到了普遍的应用。利用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白质酶分子进行定向突变和理性改造可以获得性能优良的酶突变体。

发明内容

针对现有的环氧化工艺副反应多、酸价高、环氧得率低的缺点。本发明解决的技术问题是提供一种高过氧化酶活性的PestE酯酶突变体，可用于制备高性能的环氧化物。通过对Pyrobaculum calidifontis酯酶(PestE)蛋白质结构(PDB:3ZWQ)的分析，根据PestE酯酶基因序列(genbank登录号AB078331.1)理性选择突变位点，PestE酯酶野生型DNA序列经密码子优化后为SEQ ID NO.1所示，运用定点突变的方法而获得高活性突变体。采用“原始氨基酸-位置-替换氨基酸”的方法来表示酯酶突变体中氨基酸发生的位置，所述突变体为：含有L89R突变位点以及选自L40A、F20A、F33A、L213A和F289A所组成中至少一个突变位点。

本发明的技术方案具体如下：

该突变体是对来源于Pyrobaculum calidifontis的野生型耐热酯酶进行突变获得的，野生型耐热酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述突变发生的位点包括如下至少一个突变位点：所述突变发生的位点为第89位氨基酸由L突变为R，第20位氨基酸由F突变为A，第33位氨基酸由F突变为A，第40位的氨基酸由L突变为A，第213位氨基酸由L突变为A，第289位氨基酸由F突变为A，其中第89位为必要突变位点。