[发明专利]一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法将CTAB法和SDS法进行了结合，并优化各步骤技术参数，使得本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、无污染的优点，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于标准值，完全能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组测序(Metagenomics)的要求，可直接应用于分子操作。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及应用于分子测序技术中的一种从杨树木材(分为湿心材和健康边材)中提取微生物基因组DNA的方法。

背景技术

杨树是我国重要的速生用材树种之一。第七次全国森林资源清查数据显示，我国杨树林总面积已达1010.26万hm²，其中人工林为757.23万hm²，占全国人工乔木林总面积的18.9％，栽培面积居世界首位。但湿心材现象发生十分严重，给杨木加工利用带来不利影响。据在湖北省嘉鱼县的调查，9个杨树品种的病株率都达100％，胸径处变色直径占胸径的31.38％～64.35％，变色面积达5.49％～42.31％，成年大树变色比率可达50％以上。湿心材(Wetwood)是一种世界性病害，其典型病状是活立木髓心及中央木质部呈水浸状，木材呈现褐色至红褐色，是树木生长中的一种反常现象。湿心材表现出含水率高、颜色深、抽提物多以及pH值偏酸或偏碱性，木材物理与化学性质(例如木材密度、弦向干缩系数、抗弯强度、抗弯弹性模量、离子含量等)发生变化等特点。由于湿心材干燥时易皱缩、开裂，刨削难，木材变色，且呈碱性的湿心材很难用脲醛树脂胶合，直接影响干燥、制材和胶合板质量，导致商品价值大幅下降。作为纸浆材时，还直接影响出浆率与印刷光泽度。因此，湿心材是木材加工利用中的一大难题，造成巨大的经济损失，但目前生产上缺乏有效的防治措施。

病原微生物在湿心材的形成过程中起着非常重要的作用，这是目前被普遍接受的一种观点。然而，这些病原微生物包括哪些种类，哪些微生物在其中起主导作用目前还不清楚。长期以来，由于研究手段的制约导致杨树湿心材研究进展相对缓慢。以往的研究几乎都是采用传统的组织分离培养法分离病原菌，而该方法本身存在一定不足。例如，湿心材中的气体以CH₄、N₂、CO₂等为主，不含O₂或极少O₂，所以湿心材中主要应为兼性或专性厌氧微生物；分离和培养专性厌氧菌的方法不同于分离培养需氧菌、兼厌氧性菌及真菌的方法；有许多微生物的生长条件是不确定的，易受到培养基与培养条件选择性的限制，而且菌株之间存在相互竞争，部分微生物是存活的但不可培养，因而通过组织培养法对微生物进行分离培养，进而鉴定就有较大的局限性。

目前并没有从木材中直接提取微生物基因组DNA的方法。现有的提取微生物基因组DNA的样品主要包括土壤样品、植物组织样品、可培养的微生物样品等，方法主要有试剂盒法、酶解法、化学或者热裂解法、磁珠或超声波机械破壁，又或者是上述几种方法的结合。采用这些方法提取木材中微生物的基因组DNA，得到的DNA均浓度很低，且大多污染严重，不能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组(Metagenomics)测序的要求。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从杨树木材(分为湿心材和健康边材)中提取微生物基因组DNA的方法，以满足16S rDNA/ITS测序及宏基因组(Metagenomics)测序等分子测序技术对于基因组DNA的高质量要求。

为了实现本发明目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法包含下述步骤：