[发明专利]一种高纯度D‑阿洛酮糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。

D-阿洛酮糖可通过提高细胞内谷胱甘肽水平，起到保护神经的作用，降血糖、减脂、改善产品品质、较高的抗氧化功能；作为甜味剂，D-阿洛酮糖甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，对生长小鼠几乎不产生能量，没有毒性；与果糖和果糖相比，D-阿洛酮糖能抑制小鼠肝脏脂肪合成酶活性，减少腹脂积累，可以作为一种甜味剂在辅助减肥中使用；D-阿洛酮糖显示出较强的清除活性氧簇的功能，使其在多种疾病预防和治疗中显示出潜在的医疗价值。

中国专利文献CN105602879A(申请号201610051547.3)公开了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。该发明通过利用由瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe构建重组表达质粒pMA5-RDPE，然后转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子PxylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0％降低为0.5％。最终，采用分批补料方式，在7.5L发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95U/mL和2.6g/L。但该酶的酶活仍然较低，无法满足实际生产的需要。

但目前D-阿洛酮糖存在转化率低、易分解等问题，这样大大限制了D-阿洛酮糖的应用领域，产品本身特性难以有效发挥。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法。

本发明技术方案如下：

一种D-阿洛酮糖的制备方法，步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌的发酵液经离心后，取菌体经均质处理，得到含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液；

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005，于2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

(2)配制质量浓度为20％～60％的果糖溶液，加入含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液，调pH值5.5～6.5，按质量百分比0.001％～0.005％的比例添加氯化钴，在40～60℃条件下，保温反应10～30小时，然后向反应液中流加果糖溶液，维持反应体系中果糖质量浓度为20％～60％，继续反应10～30h，停止反应，制得D-阿洛酮糖粗液；

(3)将步骤(2)制得的D-阿洛酮糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩后，再经过结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，离心条件为：温度10～20℃，转速3000r/min，时间30～50分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，均质的条件为：温度10～20℃，压力30mpa～50mpa，时间10～20min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌的发酵液的制备方法如下：

I、将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养6～12h，制得种子液；

所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.0～7.0；

II、将步骤I制得的种子液按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃发酵培养30～48h，制得枯草芽孢杆菌发酵液；

所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：