[发明专利]促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用

说明书

本发明涉及一种能促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、及其培养基、培养方法和应用。所述卡介菌多糖核酸提取液是由卡介菌菌体破碎和热酚处理获得。所述制备制备包括以下步骤：菌种培养，收集菌膜，破碎菌体，热酚处理，沉淀，进一步醇沉精制，静置洗涤后真空干燥箱中干燥，得到卡介菌多糖核酸。卡介菌多糖核酸提取液对CIK细胞有明显的诱导增殖作用，CD3和CD56双阳性明显提高且诱导培养后的CIK细胞对肿瘤生长有较强的杀伤作用，具有临床应用的潜力。

技术领域

本发明涉及中药应用技术领域，具体的说是涉及提取中药材中的有效成分，并在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力的临床的应用。

背景技术

细胞过继免疫治疗是目前的研究热点，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞，并在此基础上修复、完善机体免疫系统的生物治疗方法。CIK细胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在体外经过多种细胞因子共同诱导，能够同时表达两种膜蛋白分子即CD3和CD56的异质细胞，它不仅具有自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤特点，还具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，具有重要的免疫治疗临床应用价值。因此，CIK细胞的体外大量增殖，即提高其体外增殖速率和对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂类)和核酸组分发挥着重要的生理功能。卡介菌的细胞壁的主要成分由多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸，)和脂类构成。研究表明：可结合人和动物的Toll受体(TLR)的配体大量存在卡介菌细胞壁和其他细胞器上，而且这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，这些配体和Toll受体结合后会促进树突状细胞的成熟，并诱导IL-12的分泌，而IL-12不仅能分泌IFN-γ而且能促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化，从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应。

发明内容

利用卡介菌多糖核酸有机地结合CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，建立卡介菌多糖核酸促进免疫细胞的大量增殖和提高杀伤力的工艺体系，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。本发明目的在于提供最优卡介菌多糖核酸提取液浓度在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力方面的应用。

本发明提供了一种促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸。采用卡介菌菌体破碎和热酚处理获得的卡介菌多糖核酸。

本发明提供了一种CIK细胞培养基，包括基础培养基和卡介菌多糖核酸。

进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。

进一步地，所述基础培养基选自RPM1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基。

进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。

本发明提供了一种CIK细胞培养的方法，包括

(1)制备CIK细胞的出发细胞；

(2)配制含卡介菌多糖核酸的培养基，并添加入步骤(1)中的出发细胞，经培养获得CIK细胞。

进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。

进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。

进一步地，步骤(2)的方法包括37℃，5％CO₂培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液。

本发明还提供了介菌多糖核酸在促CIK细胞增殖分化中的应用。