[发明专利]促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用

权利要求书

1.卡介菌多糖核酸在体外培养CIK 细胞中的应用，其特征在于， CIK细胞培养过程包括制备CIK细胞的出发细胞，在出发细胞中加入含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：

1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；

2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；

3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；

4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；

5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

所述卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。

2.一种CIK细胞体外培养的方法，包括

（1）制备CIK细胞的出发细胞；

（2）配制含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，并添加入步骤（1）中的出发细胞，经培养获得CIK细胞；

所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：

1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；

2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；

3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；

4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；

5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

所述的卡介苗多糖核酸的使用量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。

3.利用权利要求2所述的CIK细胞体外培养的方法制得的CIK细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。