[发明专利]一种NADPH的分离纯化方法

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种NADPH的分离纯化方法。该分离纯化方法，包括以下步骤：将NADPH粗品溶液过滤，得供试品溶液；将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得。本发明通过优化选择反相柱层析的介质、色谱柱、流动相、梯度洗脱的步骤等，使得NADPH的分离纯化的周期大大缩短(3小时即可完成分离纯化过程)，收率较高(约50％)，纯度较高(92％)，适于NADPH的工业化生产。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种NADPH的分离纯化方法。

背景技术

NADPH即还原型辅酶，学名：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide)，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用，并且参与多种代谢反应的合成，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，还可以在暗反应中为二氧化碳的固定进行供能。在上述反应中， NADPH是NADP+的还原形式，NADPH的作用是还原剂和氢负离子的供体；同时，NADPH是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，在细胞防御活性氧(ROS)损伤方面起着重要的作用。

有文献报道，细胞的生长、分裂、分化、迁移、凋亡及衰老等许多生命活动，也与NADPH密切相关；而且，维持NADPH(NADH)的固定浓度，或者外加辅助的NADPH(NADH)，可以对抗细胞的凋亡和衰老过程，延缓机体衰老。最新的研究发现，NADPH和NADH在机体生理与病理条件下都发挥重要的功能。当前，对细胞内NADPH(NADH)作用和代谢的研究已成为国际性的研究热点。

近几年，人工合成NADPH、然后进行分离纯化是NADPH的重要来源之一。然而，现有的对人工合成的NADPH粗品进行分离纯化方法，由于分离纯化周期较长、使得在分离纯化中NADPH极易发生氧化，而且分离纯化得到的NADPH纯度也较低。

因此，在不造成NADPH损失和破坏的前提下，研究一种操作步骤简便、分离纯化周期短、适于工业化生产的NADPH的分离纯化方法具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是由于现有的NADPH的分离纯化周期较长、使得NADPH在分离纯化中发生氧化的问题，本发明要解决的第二个技术问题是现有的分离纯化得到的NADPH纯度较低的问题。

为解决上述技术问题，本发明提出一种分离纯化周期较短、分离纯化得到的NADPH纯度较高的NADPH的分离纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种NADPH的分离纯化方法，包括以下步骤：

将NADPH粗品溶液过滤，得供试品溶液；将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得。

优选地，本发明上述NADPH的分离纯化方法，

所述反相柱层析的介质为C18，颗粒度为10-100μm，粒径为

进一步优选地，本发明上述NADPH的分离纯化方法，

所述反相柱层析的色谱柱为Sepax GP-C18。

进一步优选地，本发明上述NADPH的分离纯化方法，

以8～12mM NaH₂PO₄缓冲液为流动相A，以体积分数为100％的甲醇为流动相B。

进一步优选地，本发明上述NADPH的分离纯化方法，

以10mM NaH₂PO₄缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B。