[发明专利]延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法

说明书

本发明公开了一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法；通过在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平，来提高MSC的增殖能力，保护MSC的分化能力，延缓MSC的衰老。具体是以慢病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。与现有技术相比，本发明能有效提升年轻人源MSC的体外扩增能力；能逆转老龄70‑80岁以上人源MSC的衰老症状；能促进MSC的成骨分化潜能；能抑制MSC的成脂分化潜能。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种延缓人源骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养导致衰老的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一种重要的成体干细胞(Caplan，1991)。MSC在身体器官的多个部位，如脐带血都能检测到(Goodwin et al.，2001)，其中骨髓是MSC重要的储藏部位(Fehrer and Lepperdinger，2005；Mendez-Ferret et al.，2010)。骨髓间充质干细胞具有高度的自我更新能力，同时具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力(Bianco etal.，2008a；Bianco et al.，2008b；Nombela-Arrietaet al.，2011；Pittenger et al.，1999)，参与了骨骼系统的形成和稳态保持。大部分研究将成骨、成脂肪和成软骨的三系分化能力作为定义间充质干细胞的“金标准”(Bianco et al.，2008b)。MSC细胞表面标记包括CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。

MSC可以用来移植治疗各种疾病(Ankrum and Karp，2010；Newman et al.，2009；Uccelli et al.，2008)，包括关节损伤(Barry，2003)；心肌缺血(Amado et al.，2005)，成骨发育不全症(Horwitz et al.，2002)，移植免疫排斥(Newman et al.，2009)等。但由于骨髓MSC数量比较少，因此临床应用需要分离MSC进行体外大量扩增和培养。MSC能体外培养传代30代以上(Friedenstein et al.，1987)。MSC体外传代培养过程中，前6-8代细胞相对正常(Khoo et al.，2008)，但长时间传代培养容易导致形态和分化能力发生改变，如MSC传代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潜能，但成脂分化能力却丧失了(Digirolamo et al.，1999)。人源MSC的传代培养还会导致增殖潜力的不断下降，端粒长度缩短等衰老症状(Baxter et al.，2004；Digirolamo et al.，1999；Metsand Verdonk，1981)。这些体外培养导致的MSC衰老和增殖潜力下降，限制了MSC的移植和临床治疗应用。另外，老龄人群的MSC，相对于年轻人的骨髓MSC，增殖潜能和分化能力都大幅下降(Stenderup et al.，2003)，这也限制了老龄人群MSC的移植和治疗运用。

通过细胞生物学或遗传学方法，改变MSC细胞当中衰老相关基因的表达水平，可以通过病毒载体，哺乳动物细胞表达质粒等方法转染细胞，在细胞中上调基因表达(Gronthoset al.，2003；Shi et al.，2002；Simonsen et al.，2002)。通过同源重组的遗传方法，在人类基因组AAVS1，Rosa26，CCR5位点插入目标基因cDNA(Sadelain，et al.，2012)。近年，也有通过Cas9/sgRNA介导的方式上调或下调基因的表达水平(Gilbert，et al.，2013)。

现有提高和改善MSC体外培养导致的衰老的方法有如下几种方法：

1.卡路里限制：高糖培养基容易导致MSC培养过程提早分化和衰老，如0.5g/L或者0.25g/L Glucose浓度的培养基，相对于4.5g/L Glucose的高糖培养基，可以提高MSC的存活率，CFU-F克隆形成数量可以提高10-15％(Blazer et al.，2002；Stolzing et al.，2006)。