[发明专利]一种白僵菌分离扩繁方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种白僵菌分离扩繁方法。

背景技术

白僵菌是一种子囊菌类的虫生真菌，主要种类包括球孢白僵菌和布氏白僵菌等，常通过无性繁殖生成分生孢子，菌丝有横隔有分枝。白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时产生白僵素(非核糖体多肽类毒素)、卵孢霉素(苯醌类毒素)和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，打乱新陈代谢以致死亡。其中，球孢白僵菌为子囊菌类的真菌，可工业化培养生产，人们利用其产生的分子孢子可加工成微生物杀虫剂。

中药白僵蚕也是基于白僵菌的以上特性产生的，昆虫家蚕的幼虫在未吐丝前，因感染白僵菌而发病致死，虫体僵化即为白僵蚕，外用其药，味咸、辛，性平，可治面上黑及碍容性疾病，白僵蚕含有氨基酸和活性丝光素，有营养皮肤和美容作用；所含蛋白质有刺激上皮脂腺，调节性激素分泌的作用，因而对女性性激素分泌失调引起的黄褐斑有一定疗效；含维生素E，能清除自由基，抗脂质氧化形成的老年斑；所含的活性丝光素能促使皮肤细胞新生，调节皮脂，改善皮肤微循环，可增白防晒，消除色素沉着，保持皮肤弹性。人工培养白僵菌，并采用白僵菌感染家蚕即能得到工业化的白僵蚕产品，因此，白僵菌的分离扩繁生产过程尤为重要。然而，现有白僵菌的分离及扩繁生产周期较长，在生产过程中易受杂菌污染，白僵菌产量不高，质量并不稳定，成本也较高。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种白僵菌分离扩繁方法，所述方法的工艺简单，生产成本低，生产周期短，提高了生产效率，显著减少杂菌污染，成功率高，扩繁后的白僵菌质量稳定。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种白僵菌分离扩繁方法，所述方法包括以下步骤：

(1)白僵菌孢子液制备：用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；

(2)分离纯化培养：将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4—6天，得白僵菌菌种，所述选择培养基的组分包括：PDA培养基，补充龙胆紫、苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素、放线菌酮、多果定中的至少一种；

(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2—3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖4—6份、马铃薯汁5—10份、蛋白胨2—10份、头孢霉素1—2份、BaCl₂1—2份、CaCl₂1—2份、无菌水20—80份；

(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃条件下培养5—9天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖2—5份、豆粕3—8份、玉米粉10—20份。

优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分包括：PDA培养基，补充苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素中的至少一种。

更为优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分按重量份数计包括：PDA培养基，补充脱氧胆酸钠2—4份、头孢霉素3—5份。

更为优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分按重量份数计包括：PDA培养基，补充苯菌灵1—2份、脱氧胆酸钠2—4份。

优选的，步骤(3)所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl₂1份、CaCl₂2份、无菌水70份。

优选的，步骤(4)所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。

优选的，所述白僵菌孢子液制备步骤之前，先将白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养4—5天，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子。

优选的，步骤(2)所述选择培养基的制备方法为：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，加入龙胆紫、苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素、放线菌酮、多果定中的至少一种，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素，待所述选择培养基凝固即可。

优选的，所述二次扩大培养的湿度控制在92—94％。

其中，本申请技术方案所述的白僵菌为球孢白僵菌。