[发明专利]一种酶法水解三文鱼胶原制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺

说明书

本发明设计一种酶解胶原蛋白同时制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺，其方法是以三文鱼皮为原料提取胶原蛋白，利用Vibrio sp.SQS2‑3发酵所得的胞外蛋白酶粗酶液将其水解成短肽溶液，通过3000 Da超滤管4500×g离心超滤45min后获得具有保护肌球蛋白和减缓其Ca²⁺‑ATPase活性在反复冻融中下降作用的抗冻肽，通过Sephadex LH‑20凝胶过滤层析分离下层超滤组份后，获得具有清除DPPH自由基、羟自由基以及对DNA氧化损伤具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力检测中显示出浓度依赖的抗氧化活性的抗氧化肽。LC‑MS技术鉴定出该抗氧化组分含有19条多肽。

技术领域

本发明涉及一种利用微生物蛋白酶酶解三文鱼皮胶原同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

我国海洋与淡水水域面积广阔，水产资源丰富，占世界水产品总量的36%。随着渔业的发展，水产品加工业的发展也得以推动。据统计，每年有大约两千万吨富含蛋白质的鱼类副产品，如鱼骨、鱼皮、鱼鳍和鱼鳞等，在加工过程中产生，它们大部分被直接掩埋丢弃或用于制作动物饲料、鱼粉等低值产品，不仅造成了严重的资源浪费，还直接导致环境污染。因此，开发出对水产加工业产生的废弃物进行高附加值利用的工艺，使其变废为宝，成为了缓解资源与环境的重要手段。

胶原蛋白广泛存在于动物的表皮和骨组织中，其组成单位为原胶原，每个原胶原分子有三条肽链组成，肽链为α-螺旋结构，以平行右手螺旋形式形成三股螺旋结构。胶原蛋白在氨基酸组成上最重要的特点是以“Gly-X-Y”的形成重复排列，即每隔两个氨基酸残基出现一个甘氨酸，X与Y为其它的氨基酸残基。传统上商业应用的胶原蛋白多来自于动物皮骨，但因疯牛症、口蹄疫等疾病，使人们对牲畜胶原制品安全性产生疑虑。同时由于宗教和习俗等因素，部分地区与群众拒绝使用牲畜胶原制品。许多水生生物中胶原含量非常丰富，也具有一些不同于哺乳动物源胶原蛋白的特点，水产动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量比陆地动物胶原蛋白低得多，这使得水产动物胶原的三螺旋结构的热稳定性更低，在低温下也更易溶于中性盐溶液或酸性溶液，更容易制得可溶性胶原，为胶原的提取和应用提供了有利条件。

近年来，国内外有研究报道利用副产品中的蛋白质成功制备出具有不同生物活性的肽类分子，成为食品、医药、护肤领域中的研究热点，其中包括抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽、抗冻肽等。从自然界中发现的生物活性肽种类有限，且提取量少，难度大，难以实现工业化规模的生产，而大分子蛋白质中具有大量不同的氨基酸序列信息，通过生物技术使蛋白质和多肽断裂，释放出不同结构的肽段，这为大规模获得潜在的生物活性肽提供了新的研究思路。

胶原蛋白作为一种数量丰富、来源广泛的低值蛋白，结合生物酶工程技术，开发一种对胶原蛋白高值化综合利用的工艺，对胶原蛋白进行水解，获得介于蛋白质与氨基酸之间的低聚活性胶原肽，在医药、护肤、保健、食品领域有着巨大的潜在市场价值。

发明内容

本发明针对现有生物酶解制备活性肽技术的不足，提供了一种利用微生物胞外蛋白酶酶解从三文鱼皮中提取的胶原蛋白，从不同组份中同时制备分离出具有不同生物活性的胶原肽的工艺方法，使之达到资源综合利用的目的。

步骤如下：

（一）微生物胞外蛋白酶的制备：

1、将产胞外蛋白酶细菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接种于液体种子培养基，在17°C水平摇床中震荡培养2-3天，转速为200 rpm，然后按2%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，在17°C水平摇床中震荡培养5天，转速为180 rpm，制得发酵液；