[发明专利]一种酶法水解三文鱼胶原制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺

权利要求书

1.一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：其以三文鱼皮为原料提取胶原蛋白，利用微生物发酵所得的胞外蛋白酶将胶原蛋白水解成短肽，经过分离后获得抗氧化肽与抗冻肽组份。

2.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的胶原蛋白提取方法为利用80°C水浴处理新鲜去肉三文鱼皮30 min，通过透析与冷冻干燥得到胶原蛋白固体。

3.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的微生物为从海南省海口市美兰区渠口镇的潮间带海水中分离鉴定所得Vibrio sp. SQS2-3。

4.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的微生物胞外蛋白酶制备方法为将细菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接种于液体种子培养基，在17°C水平摇床中震荡培养2-3天，转速为200 rpm，然后按2%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，在17°C水平摇床中震荡培养5天，转速为180 rpm，制得发酵液；将发酵液倒入离心管中进行冷冻超速离心，离心条件为10000 × g，4°C，30 min，然后收集上清，倒入新的离心管中，12000 × g，4°C离心15 min，重复2-3遍，直到上清沉淀较少；收集上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，然后放置在浓度为20 mM，pH 7.8的Tris-HCl中冰浴透析2 h，然后更换新的Tris-HCl继续冰浴透析2 h，最后用新的Tris-HCl浸泡透析袋，并放置在4°C冰箱中透析24 h，获得粗酶液。

5.根据权利要求4所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，Fe₂(PO₄)₃ 0.001份，人工海水100份，pH为7.8。

6.根据权利要求4所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的发酵培养基组分如下，均为重量份：玉米粉1份，麸皮0.5份，豆粕1份，Na₂HPO₄ 0.05份，KH₂PO₄ 0.02份，CaCl₂ 0.05份，Na₂CO₃ 0.05份，人工海水50份，pH为7.5-8.0。

7.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的短肽制备方法为根据酶与底物比例1：10（ml/mg）将三文鱼皮胶原蛋白与粗酶液混合，置于37°C，100 rpm恒温水平摇床中酶解120 min；将酶解液置于95°C水浴锅中加热10 min使酶失活，冷却至室温后，10000 × g，4°C离心5 min去除变性大分子蛋白，收集上清，获得胶原短肽。

8.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽与抗冻肽组份分离方法如下

a. 取权利要求7中获得的胶原短肽加入到分子截留量为3 kDa的超滤管中，4500 × g离心45 min，分别收集超滤管上下层滤液，上层为抗冻肽组份；

b. 取上述下层滤液，使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱对下层滤液进行分子筛层析：以两倍体积超纯水作为流动相平衡色谱柱（16 × 600 mm），按柱床体积3-5%上样，用超纯水洗脱3-4倍体积，流速为1 ml/min，检测220 nm吸光度，收集活性峰，并进行真空冷冻干燥，获得抗氧化肽组份。

9.根据权利要求1或8所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽具有清除DPPH自由基、羟自由基以及对DNA氧化损伤具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力检测中显示出剂量效应。