[发明专利]甘蔗花叶病毒第IV组分离物PCR检测体系的建立及应用

说明书

本研究涉及植物病毒检测，提供了一种甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)第IV组分离物的检测体系。根据SCMV第IV组分离物与其他组分离物外壳蛋白基因序列的差异设计了6对引物，从中筛选灵敏度高、特异性强的引物，并通过对PCR的反应体系的优化，建立了SCMV第IV组分离物的检测体系，进而建立了能同时检测SCMV所有分离物及SCMV第四组分离物的双重PCR检测体系。该体系可为SCMV第IV组分离物的监测及病害防控提供科学依据。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测，具体地，本发明涉及甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)第IV组分离物PCR检测体系的建立及应用。

背景技术

矮花叶病是玉米上危害最重的病毒病之一。引起玉米矮花叶病的病毒主要有玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)、约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、高梁花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)、玉米花叶病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)、白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)等。引起我国玉米矮化叶病的病毒主要是SCMV。

根据对全基因组序列的系统发育分析，SCMV分为4个组，其中第IV组是新出现的一个强毒株系，其代表分离物BD8对供试的20个玉米品种都具有很强的致病力。为了快速检测出SCMV第IV组分离物，本文通过比对GenBank中SCMV I-IV组分离物及第IV组分离物序列，在I-IV组和IV组保守区域设计引物，进而建立了检测SCMV尤其是IV组分离物的检测体系。

发明内容

我们针对SCMV I-IV组及IV组分离物分别设计了3对引物，从中筛选出特异性最强的1对引物(I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R)，进行PCR体系的优化。优化后的PCR体系为：退火温度51℃，dNTP终浓度为0.1mM，引物终浓度为0.20μM，Taq酶终浓度为0.015U/μL。利用该体系,引物对I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R均能够从50ng感病叶片或0.05ng病毒RNA中检测出SCMV的存在。通过优化两对引物浓度比例建立了能同时检测SCMV所有分离物及第IV组分离物的双重PCR体系。利用该体系从山东、河南及云南均检测出SCMV第IV组分离物的发生。本研究为SCMV尤其是SCMV第IV组分离物的快速检测提供了技术支持。

本发明实施的具体技术方案是：

1.引物的设计及筛选：将NCBI下载的SCMV外壳蛋白基因序列与本实验室获得的序列用DNAMAN软件进行比对，分别设计能同时检测SCMV所有分离物和只能检测地IV组分离物的各3对引物。通过实验，筛选特异性最强的一对引物。

2.反应体系及扩增条件的优化：从影响多重PCR扩增的退火温度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度等方面进行优化。

3.灵敏度的测定：将病毒样品和提纯病毒进行梯度稀释，确定检测体系的灵敏度。

4.双重RT-PCR的建立及应用：

通过优化引物浓度，建立了能同时检测SCMV所有分离物和第IV组分离物的双重PCR检测体系。

利用该技术检测山东、河南和云南等地SCMV第IV组分离物的发生情况。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

1)获得了对SCMV第IV组分离物特异性最强的引物；

2)获得了能同时检测SCMV所有组分离物及第IV组分离物的双重RT-PCR体系。

附图说明

图1为引物特异性分析