[发明专利]甘蔗花叶病毒第IV组分离物PCR检测体系的建立及应用

权利要求书

1.一种同时检测甘蔗花叶病毒第I-IV组分离物和特异检测第IV组分离物的双重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）针对甘蔗花叶病毒第I-IV组分离物和第IV组分离物基因组的保守区域，设计两组引物对，其中，引物对I-IV-2F/I-IV-2R对甘蔗花叶病毒第I-IV组分离物的扩增特异性最好，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；引物对IV-1F/IV-1R对第IV组分离物的扩增效率最高，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

（2）构建双重PCR检测体系，所述双重PCR检测体系包括：

终浓度为0.015U/μL的Taq DNA聚合酶、终浓度为0.1mM的dNTP、终浓度为0.6μM的引物对I-IV-2F/I-IV-2R和终浓度为0.2μM的引物对IV-1F/IV-1R；

（3）提取待测玉米叶片总RNA，用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，反转录产物作为模板，利用构建的双重PCR检测体系进行PCR扩增，PCR程序为：

94℃ 5min预变性；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸，延伸时间按每分钟扩增1kb计算，30个循环；72℃后延伸7min；

PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，120V 30min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统观测电泳结果。