[发明专利]酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开一种酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体，其包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点Nde Ⅰ和限制性酶切位点BamH Ⅰ。一种如前所述的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体的构建方法，其包括以下步骤：根据GenBank数据库收录的大鼠酪蛋白激酶Iα的核苷酸序列设计扩增CKIα的引物；获取大鼠细胞的全cDNA；利用所述扩增CKIα的引物从所述cDNA中的克隆CKIα基因；将所述克隆获得的CKIα基因与原核表达载体进行连接，获得重组的原核表达载体。本发明酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法成功利用了原核表达系统，获得了重组CKIα。

技术领域

本发明涉及一种原核表达载体构建技术，尤其涉及一种酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法。

背景技术

酪蛋白激酶Iα属于CKI家族成员，它是一类具有独特理化特性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在从酵母到人类等真核生物中，主要分布在细胞质、细胞膜、细胞核及细胞骨架等部位，并且在有丝分裂期间，还定位于突触小泡、中心体和纺锤体微管。具有组成型活力(即被分离或者原核表达的CKIα都具有活性)。CKIα可磷酸化底物蛋白质中已被磷酸化的位点，也可作为其它蛋白激酶的底物被磷酸化，参与蛋白质的级联磷酸化过程，在信号转导途径中发挥作用，进而参与包括基因表达、细胞增殖及分化、囊泡转运、mRNA加工、有丝分裂纺锤体形成等多种细胞调节过程。近几年来，人们发现CKIα在Wnt和Hh信号转导通路中扮演着举足轻重的角色，而该两条信号通路与干细胞的分化和增殖密切相关。因此对酪蛋白激酶Iα进行重组表达，并将其应用于干细胞定向分化研究意义重大。

原核表达是将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株(一般是大肠杆菌)的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达，最后再通过纯化获得所需的目的蛋白。该项技术是基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物工程中广泛使用的一种分子生物学技术。迄今为止，原核蛋白表达系统是最为成熟可靠的蛋白表达系统，能快速表达纯化各种不同来源蛋白。以其大量制备的重组蛋白可用于药物筛选、结构生物学研究、细胞生物学研究、蛋白质组学研究等的一系列生物医学领域的研究。其优点是表达周期较短，操作简单方便，且所需的成本相对较低。此外，有多种可供选择的表达元件、宿主菌株以及已构建好的表达载体，同时，又可遵循一定的技术方案对其生理学和遗传学特性加以人为的改造。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景和生理生化特性为人们所熟悉，生产技术简便，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前它也是生物技术中应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

如何利用原核表达系统获得更多更稳定的来源于真核生物的酪蛋白激酶Iα尚未有较成熟的方案。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种利用原核表达系统制备大鼠酪蛋白激酶Iα重组蛋白的方法，并提供酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法。

为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体，其包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点Nde Ⅰ和限制性酶切位点BamH Ⅰ。

优选地，所述原核表达载体为pET-16b。

进一步地，所述SEQ ID No.1编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的重组蛋白。

一种如前所述的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体的构建方法，其包括以下步骤：

根据GenBank数据库收录的大鼠酪蛋白激酶Iα的核苷酸序列设计扩增CKIα的引物；

获取大鼠细胞的全cDNA；

利用所述扩增CKIα的引物从所述cDNA中的克隆CKIα基因；