[发明专利]一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法

权利要求书

1.一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高酒精发酵液酒度、降低异戊醇含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

高产酯土著生香酵母的分离：采集传统山西老陈醋工艺发酵第3天和第6天的酒醅，分别利用孟加拉红选择培养基通过10倍递减梯度稀释法分离酵母菌，取梯度稀释样品液各100uL涂布于孟加拉红选择培养基的平板上，28℃倒置培养48h，选择菌落特征明显的单菌落在孟加拉红选择培养基上进一步划线纯化培养2~3次，纯化后转入YEPD固体斜面，4℃保存，备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得酵母菌，所得到的酵母菌通过菌落形态观察、镜检、理化特征检测、26s rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，以及产酒、产酯性能、环境耐受性检测，获得高产酯土著生香酵母：毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14，乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18；

高产酯土著生香酵母单菌株培养：Y14、Y18分别以2%的接种量接种在YEPD培养基中30℃培养20h,将菌种用冷却至室温的无菌水稀释至10⁷/ml；

高产酯土著生香酵母菌与大曲共同酒精发酵：采用稀释至10⁷/ml的高产酯土著生香酵母Y14或Y18单一菌株或Y14和Y18的联合菌株与大曲共同进行酒精发酵，强化菌株的添加比例分别为25%(ml/g)；

所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形，大小为4.6-6.5×3.8-6.5mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅白灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGTCCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP027538,其碱基序列如SEQID NO：1所示；将Y14菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y14可形成子囊孢子，用孔雀绿染色，子囊孢子呈现蓝色、绿色或无色；所述毕赤酵母属（Pichia manshurica）Y14保藏编号为：CGMCC NO.12407，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2016年4月28日；

所述乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞卵形、腊肠形，大小为4.0-7.2×3.0-5.2mm.麦芽汁琼脂斜面25℃培养1个月，菌落奶酪状，浅灰色，表面平滑，不反光，边缘整齐；在玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝；rRNA基因D1/D2区序列检测鉴定，测序引物为：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；检测结果为：Genbank序列登录号为KP339953,其碱基序列如SEQ ID NO：2所示；将Y18菌株活化，接种于醋酸钠产孢培养基平板上，25℃培养4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍镜观察子囊孢子的形状及孢子数目，Y18不形成子囊和子囊孢子；所述乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)Y18保藏编号为：CGMCC NO. 12409，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2016年4月28日。