[发明专利]基于二甲基化多重标记及特征碎片离子的绝对定量方法

说明书

本发明涉及一种多样品多靶标的高通量精确蛋白质组绝对定量方法。它是利用二甲基化反应标记肽段的N末端和赖氨酸氨基，通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现待测蛋白和/或肽段样品及已知量目标内标物中的蛋白和/或肽段的多重标记。标记后的样品使用液质联用系统进行分析，提取样品和内标物的二级谱中特征碎片离子峰面积进行定量，得到待测样品目标蛋白的绝对量。该方法分析通量高、大大节约分析时间、标记试剂廉价，实际应用性强、定量准确度高，精密度好，动态范围宽，满足基于内标物的多样品分析或基于标准曲线的多靶标分析的需求。

技术领域

本发明涉及一种多重标记的绝对定量方法，可实现多蛋白质或肽段的多样品及相应标准曲线的同时定量，实现多样品多靶标的精确绝对定量。该发明具有方法简单廉价，标记效率高，定量准确度高、精密度好，动态范围宽，绝对定量通量高，免除绝对定量方法优化步骤，适用样品种类宽，方法实用性强等优点。对大样品量的蛋白质组绝对定量分析有显著优势。

背景技术

蛋白质的含量变化与生物体的生命过程息息相关，研究蛋白质的绝对量在了解蛋白质在相互作用网络中的功能、帮助临床疾病的诊断和治疗中有无可取代的作用。对于目标蛋白的绝对定量，采用目标型的质谱方法已经成为实现高重现性、高灵敏度的绝对定量的金标准。

在目标物的绝对定量方法中，传统的选择离子监测(SRM)、多反应监测(MRM)技术已经得到了广泛的应用，但母子离子对选择和方法构建过程限制了SRM/MRM方法的通用性。近年来发展的平行反应监测(PRM)技术可以同时采集一条肽段的全部碎片离子，有效的降低了方法建立的复杂性，同时也实现同时定性定量。但两种方法的通量都不高，难以高通量的验证蛋白浓度。为了提高分析样品的通量，有研究利用化学标记策略增加分析通量，如利用iTRAQ(Nat.Commun.2015,6,5924)、iDiLeu(J.Am.Soc.Mass Spectrom.2015,26,107.)等标记试剂标记，二甲基化标记(Anal.Chem.2012,84,4999.)，中子编码赖氨酸标记(Anal.Chem.2016,88,3295.)。但上述方法存在标记多重度限制或对质谱分辨率要求较高等不足。

发明内容

本发明发展了一种基于二甲基化多重标记及特征碎片离子的蛋白质组绝对定量方法，并发展了相应的质谱采集策略。通过上述方法，不仅能够增加同时分析样品的通量，还能够通过绘制标准曲线提高绝对定量的准确度。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1、合成目标蛋白和/或肽段的内标物，方法适用于现有绝对定量所用内标物，内标物种类包括肽段、肽段串联体蛋白和蛋白质。内标物获取方法兼容化学合成、细胞培养和无细胞培养。

2、待测蛋白质样品与目标蛋白和/或肽段的内标物经过变性还原烷基化后，按照一定的酶/蛋白比例加入酶，孵育过夜。

3、对待测样品及内标物酶解所得的肽段进行二甲基化标记，控制条件pH值为7.5～12，标记时间0.5～12h。

4、重复上述步骤，根据实验设计将其他待测样品和已知量目标内标物进行不同同位素组合的二甲基化多重标记，上述多重标记方法中，八重标记试剂选择为：

1-plex：CH₂O+NaBH₃CN(Dim28)；

2-plex：¹³CH₂O+NaBH₃CN(Dim30L)；

3-plex：CH₂O+NaBD₃CN(Dim30H)；

4-plex：¹³CH₂O+NaBD₃CN(Dim32L)；