[发明专利]活细胞传感仪在植物细胞低温保藏中的应用

说明书

本发明涉及活细胞传感仪在植物细胞低温保藏中的应用。首次将活细胞传感仪作为一种快速评价细胞冻存效果的方法，通过细胞冷冻和复苏前后活细胞电容值的变化来评价冷冻保护剂对细胞保存的效果。采用活细胞电极则可以快速、准确地表征活细胞的浓度。将活细胞电容值与2,3,4‑氯化三苯基四氮唑(TTC)的检测结果结合，可达到快速定量评价冷冻方法对细胞保存的效果，克服了以往植物细胞保藏方法的低效性和无定量性。本发明的方法与传统方法相比，细胞低温保藏综合得分可以提高5倍或以上。

技术领域

本发明属于细胞检测领域，更具体地，本发明涉及活细胞传感仪在植物细胞低温保藏中的应用。

背景技术

现有的植物细胞系的保种主要通过以下两种方式。第一种是在生长培养基中进行继代保存，另一种则是对细胞进行低温冷冻保藏。通过长期继代而保存细胞存在费时费力、成本昂贵，并且会出现植物细胞特性消失等缺点。而细胞在超低温的条件下时，会停止内部的一系列代谢活动，并能够保持细胞自身的特性，大大降低细胞特性消失的风险。而植物细胞超低温保藏中，冷冻保藏的方法则对于细胞能够保存成功起到决定性作用。由于植物细胞中含有大量的水分，给冷冻保存带来困难。因此需要选择适合的冷冻保护剂，以及优化适合的冷冻保存方法，以最有效地控制细胞内含水以及冷冻过程中对细胞的损伤，以期可以在细胞冷冻保存后获得更高的细胞活性。

植物细胞在冷冻保藏过程中会由于内部或者外部水结成冰晶而造成细胞破裂，以往，均是采用细胞线粒体活性测定的方法来间接反映细胞在冷冻保藏后的活性情况。但是，这种测定操作烦琐，处理条件复杂，耗时长，在实际操作存在困难。

活细胞传感仪是利用电容法测量细胞溶液中的活细胞浓度。细胞溶液中存在的交变电场会使其中的离子发生迁移，而活细胞具有完整的绝缘性细胞膜，其中的离子受到束缚导致细胞膜极化，这使得细胞成为一个个微小的电容器。测量得到的电容值与溶液中的细胞量存在良好的线性关系。目前活细胞传感仪常被应用于发酵过程中测定发酵液中细胞量，尚未被应用于细胞冷冻保存中。

发明内容

本发明的目的在于提供活细胞传感仪在植物细胞低温保藏中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高冷冻保存细胞的细胞活力的方法，所述方法包括：

(1)用0.15～0.3M蔗糖作为预处理剂对处于对数生长期的植物细胞进行预处理；

(2)将细胞加入到含有冷冻保护剂的培养基中，进行低温保存；所述的冷冻保护剂为DMSO和蔗糖，在培养基中的终浓度为：

DMSO：8～12％(w/v)；更佳地为9～11％(w/v)；

蔗糖：8～12％(w/v)；更佳地为9～11％(w/v)。

在一个优选例中，所述方法的步骤(1)中，还包括：对预处理后的细胞测定并记录电容值A₁；

步骤(2)中，冷冻保存后，还包括：对植物细胞进行细胞复苏，利用活细胞传感仪测定并记录电容值A₂；

以细胞的基础电容值为A₃；以式(I)获得细胞活力保存率：

细胞活力保存率＝(A₂-A₁)/(A₃-A₁) (I)；

根据获得的细胞活力保存率，评价植物细胞的细胞活力。

在另一优选例中，所述的植物细胞是罗汉果植物细胞；较佳地是罗汉果愈伤组织细胞。

在另一优选例中，所述方法的步骤(1)中，所述的蔗糖存在于液体培养基中，将处于对数生长期的植物细胞加入到液体培养基中，进行预处理。