[发明专利]一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法

说明书

本发明属于抗菌肽领域，公开一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽及其合成方法。该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，肽链序列依次如SEQ ID No.2‑5所示。以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，采用固相合成法合成。这四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效率，部分菌的抑制率甚至显著高于细胞穿膜肽Tat(49‑57)；并且，这四种衍生抗菌肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。

技术领域

本发明属于抗菌肽领域，具体涉及一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法。

背景技术

抗生素在预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要的作用。然而不合理的使用抗生素导致随后出现的多重耐药菌以及耐药菌感染引发的死亡等问题已成为世界范围内公共卫生难题，为此迫切需要能够抵抗多重耐药菌的新的抗生素。抗菌肽独特的抑菌机制及不易产生耐药性、对正常细胞的无毒性等优点使得其有望成为新一代有效的抗菌药物，应用前景和使用价值得到广泛关注。研究抗菌肽的抑菌机制，通过改造设计进一步改善抗菌肽的活性，增强其抗菌效果，成为目前该领域的研究热点。细胞穿膜肽Tat(49-57)是Tat蛋白行使转导功能的最小结构单元，其可以携带各种外源物质透过细胞膜进入细胞内，定位在细胞内核染色体上。这些特点使细胞穿膜肽Tat(49-57)介导各种外源分子跨越生物膜屏障定位于细胞核，成为高效、安全的载体成为可能。如能基于细胞穿膜肽Tat(49-57)，设计并制备出一种抗菌肽，无疑具有显著的意义。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽，该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次为YGRKKRRQRRR（如SEQ ID No.2所示）、YYRKKRRQRRR（如SEQ ID No.3所示）、FGRKKRRQRRR（如SEQ ID No.4所示）、FFRKKRRQRRR（如SEQ ID No.5所示）。

合成方法：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌肽的序列，从C-端到N-端将相应的氨基酸进行缩合偶联；所有的氨基酸均偶联结束后，将最后一个氨基酸的Fmoc保护基脱除掉，洗涤，吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后，过滤，收集滤液于冰乙醚中，置于冰箱中静止直至有沉淀出现，离心，弃去上清液，再重复加入冰乙醚--离心数次，最后一次将上清液弃掉，剩下的沉淀经干燥，所得固体粉末进一步用二次蒸馏水溶解后，送去RP-HPLC（反相高效液相色谱）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌肽。

各目标抗菌肽的RP-HPLC分离纯化条件优选如下：

Tat(YG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250 mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：11%~31%B相/0~20min（即0~20min，B相由11%上升到31%； 20min~结束，B相一直都是31%）；