[发明专利]基于col2a1启动子的eGFP表达载体构建及在转基因斑马鱼中的应用

说明书

本发明涉及基于col2a1启动子的eGFP表达载体构建及在转基因斑马鱼中的应用。具体而言，本发明提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有col2a1启动子和与所述启动子操作性连接的荧光蛋白的编码序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体。因此本发明提供使用所述表达载体构建的转基因斑马鱼。本发明还涉及采用本发明方法获得转基因斑马鱼在筛选相关化合物中的应用。

技术领域

本发明涉及基于col2a1启动子的eGFP表达载体构建及在转基因斑马鱼中的应用。

背景技术

胶原蛋白在动物体多种组织和器官中都广泛存在，包括大脑及神经元，血管，皮肤，肌肉，软骨和骨骼等。胶原蛋白一般由临近细胞合成并分泌到胞外，是细胞外基质的主要组成部分之一，起到细胞间组织、黏合和信号传递等至关重要的作用。软骨作为胶原蛋白的主要承载组织器官之一，同时表达着包括Col1a1，Col2a1和Col10a1等多种胶原蛋白，其中Col2a1在软骨细胞形成和发育的全部时期都保持着极高的表达，成为软骨细胞和软骨组织的特异性标记之一。

软骨是动物重要又特殊的支撑器官和组织。在胚胎发育时期，软骨首先形成，并在发育过程中主导成骨过程并最终形成成熟的骨骼(软骨内成骨，Endochondralossification)。软骨内成骨是长骨等骨骼的主要形成方式，包括股骨(Femur)、胫骨(Tibia)、尺骨(Ulna)、桡骨(Radius)、肱骨(Humerus)等在内的全身大部分主要四肢骨、以及椎骨(Vertebra)、肋骨(Rib)等主要的躯干支持骨骼，其产生和发育都来源于软骨内成骨过程。如果软骨发育异常，就会影响到后续的成骨过程，导致躯体的支撑和运动作用遭到破坏，严重影响个体发育以及功能。除此之外，在成体中仍有一部分组织始终维持软骨状态，包括鼻软骨、耳软骨和哺乳动物关节处软骨等等。这其中，关节软骨(Articularcartilage)尤为重要，能够为关节活动提供必要的缓冲和支撑。目前为止，关节炎(Arthritis)是发病率最高的骨科疾病之一，严重影响到患者的生存和生活质量。关节炎的发病机理有许多种，其中包括炎症反应诱导的风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)和关节软骨损伤导致的骨关节炎(Osteoarthritis)。成年关节软骨的损伤会导致骨关节炎，是一种以关节软骨退行性病变及继发性骨质增生为主要改变的慢性关节疾病。无论哪种关节炎，最终都会导致关节腔液体炎症，关节表面的软骨受到损伤。

软骨是始终没有血管侵入供能的器官之一，这就导致软骨损伤特别是成年关节软骨的损伤，往往是医学上不可逆转的过程。目前为止，对于软骨损伤以及软骨性骨关节炎的药物，主要包括：

1、快作用缓解症状药物:迅速镇痛和改善症状作用，但不影响骨关节炎病理和病变结构，无法从根本上治疗骨关节炎。此类药物主要包括镇痛药、非甾体抗炎药和糖皮质激素等。

2、慢作用缓解症状药和软骨保护剂:减缓或逆转骨关节炎发病处的软骨降解，缓解疼痛和改善关节功能，干扰骨关节炎病理过程。但已经受损了的软骨细胞并不能得到修复，效果不够强且见效缓慢。此类药物主要包括透明质酸、硫酸基葡萄糖等。

3、其他药物，包括双磷酸盐、细胞因子、维生素A、C、D和E等等。

综合以上，我们发现现行的骨关节炎治疗药物大多局限于拮抗炎症和疼痛反应、增强关节滑液活性等；新药研究和开发也往往局限于体外促进软骨细胞活性方面，缺乏行之有效的动物模型。

相对于哺乳动物，身体透明的斑马鱼是研究软骨发育的一个优秀模型。自从1995年第一条绿色荧光蛋白转基因斑马鱼出世以来，国内外已建立了多种类型的转基因斑马鱼，用于基因功能分析、细胞来源及谱系、药物筛选等研究。

发明内容

本发明旨在利用col2a1启动子启动荧光蛋白表达的表达载体提供一种可视化软骨细胞活性和位置的动物模型，建立稳定的体内筛选软骨及骨关节炎药物筛选的方法。