[发明专利]基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法

说明书

本发明公开了一种基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法，包括由插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列构建的双荧光报告系统表达载体，本发明所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统利用并模拟真核细胞内的不同修复机制对报告系统中的相应的荧光表达盒进行修复，可通过流式细胞仪对双荧光报告系统表达载体两种报告基因的表达进行量化，在载体水平一次性报告检测真核细胞中某一确定基因位点HR、SSA和NHEJ的修复效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一套基于人工核酸酶介导的快速、高效、可视化细胞修复效率报告系统的构建方法，具体涉及应用基因工程技术在报告载体水平模拟真核细胞内特定基因位点的损伤，对不同修复通路的修复效率进行可视化的粗略定量和流式分析精确定量的方法。

背景技术

基因组编辑技术是针对基因组进行基因修饰和改造的一种生物工程技术，该技术是人们认识、鉴定基因功能的“金钥匙”。早期的转基因技术主要是利用随机插入的方式将外源基因整合到基因组中，比较常用且高效的手段是转座子系统介导的转座效应和逆转录病毒介导的整合效应。但是利用以上两种效应介导的基因敲入一般具有一定的随机性、多拷贝性和细胞毒性，有着潜在的安全问题，因此在基因治疗和转基因育种等领域的研究应用中受到了很大的限制。基因组靶向编辑技术则可以针对基因组某一特定位点进行靶向编辑和修饰操作，避免了随机性和多拷贝性，降低了细胞毒性。传统的基因组靶向编辑技术通过打靶载体，利用细胞内自发的同源重组(Homologous recombination,HR)效应实现目的基因的定点插入。打靶载体需要含有两段很长的同源臂(基因组中靶基因的序列)、筛选标记基因以及需要引入的外源基因序列。在基因组DNA复制过程中，打靶载体的同源臂在自发同源重组的机制下能整合至基因组相应位点，同时将外源基因插入靶基因位点。最后通过筛选标记基因筛选获得目的基因插入的阳性细胞克隆。但是，对于高等动物而言，这种自发重组的效率非常低(10^-6～10^-7左右)，且单纯地延长打靶载体中同源臂序列的长度并不能有效的提高其重组效率。因此，这种依靠自发重组所介导的基因组靶向编辑技术由于效率低、经费时间投入大和实验技术要求高等缺点，已经难以满足应用的需求；特异性和高效性一度成为该技术中的两个重点和难点。

人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)的出现，为基因组靶向编辑技术带了新的革命。新型的基因组靶向编辑技术主要是通过人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂(Double-stranded breaks,DSBs)，利用含有同源臂的供体DNA介导同源重组修复机制，进而实现基因的插入、删除和点编辑。人工核酸内切酶可以根据特异性靶序列DNA进行专门的改造和定制，大大提高了基因组靶向编辑的特异性；同时，在基因组DNA中引入双链断裂后，基因组靶向编辑的效率也得到了飞跃性的提高。目前，应用于基因组靶向编辑技术中的人工核酸内切酶主要包括3种：锌指核酸酶技术(Zinc fingernucleases,ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9核酸酶技术(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))。