[发明专利]基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统及其建立方法

权利要求书

1.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：包括CRISPR/Cas9表达载体以及双荧光报告系统表达载体；所述CRISPR/Cas9表达载体包括用于表达对目的基因靶位点具有剪切活性的Cas9核酸酶的序列；双荧光报告系统表达载体包括顺次设置的以下元件：插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒、完整的报告基因II表达盒以及报告基因I的截短序列，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

2.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述CRISPR/Cas9表达载体包括顺次设置的抗性筛选基因表达盒、目的基因靶位点sgRNA序列表达盒和hSpCas9基因表达盒。

3.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I选自荧光蛋白报告基因GFP，所述报告基因II选自荧光蛋白报告基因DsRed。

4.根据权利要求1或3所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I表达盒包括顺次设置的EF1a启动子、位于目的基因靶位点插入位置之前的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-L、目标基因靶位点、位于目的基因靶位点插入位置之后的荧光蛋白报告基因GFP阅读框部分GFP-R以及polyA；所述报告基因II表达盒包括顺次设置的CMV启动子、荧光蛋白报告基因DsRed阅读框以及β-globin polyA。

5.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述双荧光报告系统表达载体还包括抗性筛选基因表达盒。

6.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述报告基因I的截短序列为缺少起始密码子的荧光蛋白报告基因GFP阅读框。

7.根据权利要求1所述基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统，其特征在于：所述细胞为真核细胞。

8.基于人工核酸酶的可视化细胞修复效率报告系统的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)确定目的基因靶位点，根据目的基因靶位点构建CRISPR/Cas9表达载体；

2)将报告基因I的截短序列、报告基因II表达盒以及插入有目的基因靶位点的报告基因I表达盒顺次插入同一骨架载体，其中，报告基因I、II具有不同的检测信号，目的基因靶位点的插入位置位于报告基因I的阅读框内并导致该阅读框打断，所述报告基因I表达盒与报告基因I的截短序列的转录方向相同，所述报告基因I表达盒与报告基因II表达盒的转录方向相反，报告基因I的截短序列是仅作为修复模板的自转录起始点截短的报告基因I阅读框片段。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)根据目的基因靶位点通过设计的退火引物拟合得到目的基因靶位点序列片段；

1.2)将所述靶位点序列片段插入pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体的BbsI多克隆位点，获得中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9；

1.3)从中间载体pX330-U6-VEGFA.sgRNA-CBh-SpCas9中克隆剪切目的基因靶位点所需的sgRNA和Cas9表达盒片段，将该片段插入pLL3.7载体的多克隆位点，得到基于pLL3.7骨架的CRISPR/Cas9表达载体。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：

2.1)将不含PolyA尾的荧光蛋白报告基因DsRed表达盒插入pXL-BAC II载体的多克隆位点，获得中间载体pXL-DsRed box without polyA，将β-globin polyA片段插入中间载体pXL-DsRed box without polyA，获得包含完整表达盒的荧光蛋白报告基因DsRed表达载体pXL-DsRed；

2.2)构建阅读框中插入有目的基因靶位点的荧光蛋白报告基因GFP表达盒片段，将该片段插入pXL-DsRed中的多克隆位点，获得中间载体pXL-EF1a.GFP-DsRed；

2.3)将荧光蛋白报告基因GFP的截短序列插入到pXL-EF1a.GFP-DsRed中的多克隆位点，获得双荧光报告系统表达载体。