[发明专利]一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法

说明书

本发明涉及一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法。具体而言，本发明提供一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，所述方法包括以每1×10⁵个小孢子1.0×10⁶～2.0×10⁶个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。本发明还涉及采用所述农杆菌转化大麦小孢子的方法制备大麦小孢子愈伤组织以及再生植株的方法。本发明通过降低农杆菌接种量，减少培养基更换次数，减少农杆菌和小孢子共培养时间，使农杆菌转化小孢子技术操作更加简单、省时、省钱。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法。

背景技术

常规育种方法主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然方式来积累优良基因，或者采用人工杂交的方法，进行优良基因在不同品种之间的重组而实现遗传改良。随着分子生物学的发展，能和传统育种方法互补的分子育种手段应运而生。转基因方法可以在短时间内定向培育出抗病抗逆性强、产量高、品质好的作物品种，并且抗病虫害的品种可以减少化学农药的使用，符合生态环境保护的长远利益。

大麦是世界第四大禾谷类作物，生长周期短，环境适应性强，种植范围广。近年来，大麦已完成全基因组测序，并建成高密度遗传图谱，这将推动大麦重要基因的定位和克隆。随着大麦基因组信息的不断完善，需要对大量的目标基因开展功能研究。大麦转基因技术是实现基因功能验证的重要一环，同时将成为作物育种的重要方法。

植物小孢子(Microspore)是由花粉母细胞经减数分裂后形成的四分体产生的单倍体性细胞，在离体胁迫条件下可以由原有的配子体发育途径转向孢子体发育途径，经胚胎发育形成完整植株。利用这一单倍体性细胞培养体系进行基因转化，可快速通过染色体加倍可以快速纯合、稳定下来，同时可以获得高频再生植株。因此，小孢子是优良的转基因受体。Kumlehn等(2006)报道了一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，但是其操作复杂，转化需要多种培养基；耗时较长，小孢子和农杆菌共培养需要一个月。

发明内容

本发明第一方面提供一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，所述方法包括以每1×10⁵个小孢子1.0×10⁶～2.0×10⁶个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。

在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×10⁵个小孢子1.0×10⁶～1.5×10⁶个农杆菌。

在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×10⁵个小孢子1.3×10⁶～1.4×10⁶个农杆菌。

在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.5×10⁶～2.5×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×10⁶～2.3×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×10⁶～2.1×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

在一个或多个实施方案中，接种前，将所述小孢子悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L，然后接种农杆菌。