[发明专利]一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法

权利要求书

1.一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，其特征在于，所述方法包括以每1×10⁵个小孢子1.0×10⁶～2.0×10⁶个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×10⁵个小孢子1.0×10⁶～1.5×10⁶个农杆菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×10⁵个小孢子1.3×10⁶～1.4×10⁶个农杆菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，接种前，将含小孢子的悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L，然后接种农杆菌。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.5×10⁶～2.5×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×10⁶～2.3×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×10⁵个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×10⁶～2.1×10⁶个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，用诱导培养基配制所述小孢子悬浮液，其中，所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有60～120g/L的麦芽糖，0.3～0.8mg/L的KT，0.4～1.2mg/L的2,4,5-T和/或2,4-D，0.965～0.985g/L的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸，400～2500mg/L的水解干酪素和400～2500mg/L的谷氨酰胺，pH为5.5～6.2。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为N₆基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。

10.一种制备大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)如权利要求1－9中任一项所述用农杆菌转化大麦小孢子；

(2)清洗步骤(1)的小孢子；和

(3)用含头孢噻肟钠、氨苄青霉素和乙酰丁香酮的诱导培养基室温培养步骤(2)获得的所述小孢子9天；

从而获得大麦小孢子愈伤组织。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导培养基为制备小孢子悬液所用的诱导培养基，添加的头孢噻肟钠的浓度为90～110mg/L，氨卞青霉素的浓度为90～110mg/L，乙酰丁香酮的终浓度为90～110mg/L。

12.一种制备大麦再生植株的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)采用权利要求10或11所述的方法制备获得大麦小孢子的愈伤组织；和

(2)用分化培养基培养所述愈伤组织；

从而获得再生植株。