[发明专利]一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法

说明书

本发明提供了一种从芽孢杆菌发酵液中快速定量检测芽孢体和营养体的方法。包括芽孢萌发、营养体细胞NADH的提取及其荧光检测。将营养体细胞离心得菌体，经提取NADH并测定荧光强度；然后将芽孢细胞经过萌发剂萌发，在细胞不显著增殖的前提下在细菌培养液混合1.5h得到由芽孢转化成的营养体细胞，检测细胞NADH含量，最后通过增加的NADH含量计算出芽孢的浓度。本发明可适用于基于芽孢杆菌纯培养的发酵体系，尤其是以芽孢杆菌作为发酵剂生产微生态制剂，能实现发酵过程监控或者终端产品的快速、灵敏测定。亦可用于食品、环境中的芽孢数量的定量检测。

技术领域

本发明具体涉及一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中芽孢体和营养体的方法，特别是基于芽孢体和营养体细胞中NADH的差别实现两种不同形态细胞的快速定量测定，属于微生物发酵和检测技术领域。

背景技术

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧并能够产生具有抗逆性的内生孢子的杆状细菌，因为芽孢杆菌的芽孢特性使其能够对热、紫外线、辐射等不利条件有很强抗性。芽孢杆菌中具有很多特殊功能的菌株，在实际应用中具有较大价值。有的菌株能分泌多种酶类，是酶制剂的良好来源；大部分菌株与动植物关系密切互惠共生，可以用于益生菌制剂和菌肥；有的还可以用于生产微生物农药；芽孢杆菌还能在农药降解、污染净化等环保领域发挥重要作用。

在应用芽孢杆菌进行发酵生产时，都需要监控芽孢杆菌的生长代谢和菌体细胞累积情况，而基于芽孢杆菌特殊的生理特征，在生长后期、营养缺乏或者产物抑制等情况下芽孢杆菌发酵时伴随有大量芽孢体产生，某些发酵调控需要尽可能减少芽孢的生产，如酶制剂的扩大生产；而有些则需要创造条件促进芽孢积累，如芽孢类益生菌的制备。无论哪种情况均需要对发酵基质中的芽孢和营养体分别进行定量测定，通常其测定方法也均是参照普通细菌总数的测定方式，即传统的平板计数法，培养周期长，人为误差较大，干扰因素比较多。对于芽孢杆菌而言，传统方法无法特异性将芽孢体和营养体区分开，实际操作时一般根据芽孢的耐热性通过加热处死营养体后再进行平板计数来定量测定芽孢，加热的过程本身亦会促进营养体向芽孢体的转变，因此，对芽孢杆菌的定量测定而言，常规的测定操作更繁琐，误差更大，不适合现场实时检测。

目前已有其他替代技术应用各种微生物快速检测，如PCR技术、ELISA法、基因芯片技术、生物传感法、免疫荧光技术以及基于菌体特定的荧光分子的生物荧光法(ATP、NADH)等。这些手段大大提高了检测速度，并具有一定的灵敏性，但这些方法缺乏通用性，需要昂贵的仪器及其配套试剂，或者操作过程相对复杂，推广应用难度较大。尤其对于芽孢杆菌而言，缺乏特异性的区分其营养体和芽孢体的检测方法和技术。

发明内容

本发明提供了一种从芽孢杆菌发酵液中快速定量检测芽孢体和营养体的方法，该方法能有效区分芽孢和营养体细胞，而且方法简单，灵敏度高，重现性好。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，包括以下步骤：(1)将待测的芽孢杆菌发酵液离心、洗涤并重悬到缓冲液中，充分混匀后得到菌悬液；

(2)量取菌悬液，对菌悬液中的NADH进行提取，提取液采用浓度为1.5～2mol/L的KOH乙醇溶液，将提取液与菌悬液按照不小于3：1的体积比充分混合均匀，加热至80～90℃，在此温度下处理30～60分钟，处理完毕后离心取上清液，检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；

(3)再次量取步骤(1)中的菌悬液，将其放在含有外在萌发剂的培养基中进行培养，培养至菌悬液中的芽孢体充分萌发变成营养体，然后采用与步骤(2)中相同的方法对培养后的菌悬液中的NADH进行提取，并检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；