[发明专利]一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法

权利要求书

1.一种快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将待测的芽孢杆菌发酵液离心、洗涤并重悬到缓冲液中，充分混匀后得到菌悬液；

(2)量取菌悬液，对菌悬液中的NADH进行提取，提取液采用浓度为1.5～2mol/L的KOH乙醇溶液，将提取液与菌悬液按照不小于3：1的体积比充分混合均匀，加热至80～90℃，在此温度下处理30～60分钟，处理完毕后离心取上清液，检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；

(3)再次量取步骤(1)中的菌悬液，将其放在含有外在萌发剂的培养基中进行培养，培养至菌悬液中的芽孢体充分萌发变成营养体，然后采用与步骤(2)中相同的方法对培养后的菌悬液中的NADH进行提取，并检测上清液中NADH的荧光强度，记录检测结果；

(4)取已知初始活菌浓度的营养体悬液，分别进行稀释，然后采用与步骤(2)中相同的NADH提取及荧光强度检测方法，作出活菌浓度与NADH荧光强度的关系曲线，并以此曲线作为标准曲线分别计算出步骤(2)和步骤(3)中荧光强度检测结果所对应的活菌浓度值，其中步骤(2)所对应的活菌浓度值即为营养体浓度值，将步骤(3)所对应的活菌浓度值减去步骤(2)所对应的活菌浓度值即为芽孢体浓度值。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，其特征在于：所述的荧光强度检测中的检测参数为：扫描速度3000nm/min；EX狭缝10.0nm；EM狭缝20.0nm；光电倍增管电压400V；响应0.08s；激发波长为344nm，发射波长为456nm。

3.根据权利要求1所述的快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，其特征在于：步骤(3)中所述外在萌发剂为含有L-Ala，L-Gln和L-Val营养性萌发剂的液体培养基。

4.根据权利要求1所述的快速定量检测芽孢杆菌发酵液中营养体和芽孢体的方法，其特征在于：步骤(4)中标准曲线的具体绘制方法为：取OD_600nm为0.8的营养体悬液，采用平板稀释法进行平板活细胞计数，确定其初始的活菌浓度，以确定活菌浓度的营养体悬液为基础，分别进行2倍、10倍、20倍、100倍、200倍、1000倍梯度稀释，对稀释的菌悬液进行NADH提取和荧光检测，空白为Tris-HCl缓冲液，从而根据检测结果作出活菌浓度与NADH荧光强度的关系曲线。