[发明专利]一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法

说明书

本发明涉及一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，属于植物保护技术领域。该方法包括本氏烟育苗、抗性鉴定烟苗准备、接种缓冲液的配制、本氏烟烟苗接种和抗病性鉴定五大步骤。本发明的原理是在进行烟草抗病性鉴定前，将田间采集的番茄斑萎病毒毒源在本氏烟上活化，采集本氏烟上的发病组织作为毒源进行抗病性鉴定。本发明可显著提高番茄斑萎病毒接种效率，实现大规模数量的烟草品种抗病性鉴定，有效提高抗病性鉴定效率，特别适合从数量庞大的种质资源中筛选抗病靶标品种；并且减少了不同操作人员间的人为误差，烟苗抗病性鉴定结果能够准确反映烟苗在田间的抗病能力。

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法。

背景技术

番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对烟叶生产构成了巨大的威胁。在局部地区可造成60％以上的严重损失，并有扩大和加重的趋势。现有的主栽烤烟品种均能被番茄斑萎病毒侵染，成为番茄斑萎病毒流行、爆发的潜在威胁。由于其传播介体——蓟马具有发育周期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗TSWV的烤烟品种是最经济、最有效的手段。

由于传毒蓟马个体小，饲养蓟马、分离无毒和带毒蓟马需要较高的专业技术等限制，人工摩擦接种番茄斑萎病毒是抗病品种鉴定最常用的接种方法。然而具体操作下来，发现从田间采集的番茄斑萎病毒病叶直接接种烟草效率仅为60-70%，难以满足烟草抗性鉴定的需要。推测原因为番茄斑萎病毒在作物上会产生坏死表型，坏死区域的细胞中病毒浓度较低，因此降低了病毒接种的起始浓度，造成了接种效率不能满足抗性鉴定的需求。为加快抗病品种的鉴定和选育，急需发明一种改进的高效的人工接种方式。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，利用本发明所述的方法，能显著提高病毒接种的起始浓度，进而提高番茄斑萎病毒的接种效率，对于单株植物，能够准确反映其对番茄斑萎病毒抗病性，同时，可鉴定各品种烟苗对番茄斑萎病毒的抗感性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，包括如下步骤：

步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；

步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；

步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；

步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗，具体步骤如下：

取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；

接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；

接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；