[发明专利]一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法

权利要求书

1.一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；

步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；

步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；

步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗，具体步骤如下：

取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；

接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；

接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；

涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；

15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；

步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源1-2g放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g 200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；

接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；

接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100 ul；

涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；

每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查3-4次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%；

所述的发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。

2.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗所采用的TSWV毒源为带TSWV病毒的烟草叶片。

3.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种；

步骤（5）中，本氏烟TSWV毒源汁液接种于步骤（2）获得的抗病性待检烟苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种。

4.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）涂擦后，均采用普通喷壶喷水冲洗接种过的叶片1-2次。