[发明专利]毛细管电泳结合UPLC-MS分析PQQ对儿茶酚胺神经递质调节作用的研究方法

说明书

毛细管电泳结合UPLC‑MS分析PQQ对儿茶酚胺神经递质调节作用的研究方法，属于生物分析技术领域。本发明采用阳离子固相萃取对脑组织进行提取，测定了慢性应激抑郁模型鼠脑内儿茶酚胺含量的变化及PQQ与儿茶酚胺反应产物变化，使PQQ与NE、E及产物达到较好的分离，并采用UPLC‑MS对PQQ与儿茶酚胺反应产物进行鉴别，结果发现PQQ与NE发生反应生成PQQNE，而与E不发生反应。慢性应激抑郁模型组在额叶及海马NE含量显著升高，而给予一定剂量PQQ组NE含量显著降低，E含量各组无显著差异。PQQ对儿茶酚胺神经递质的调节可能主要通过调节NE，而对E不具有调节作用。对抑郁症疾病机理及抑郁症靶向药物研究具有指导意义。

技术领域

吡咯并喹呤醌（PQQ）对儿茶酚胺神经递质的调节作用的研究方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E），是人体内一类重要的儿茶酚胺神经递质（结构式见下图）。其结构中含有多个羟基活性基团。

儿茶酚胺神经递质由肾上腺髓质嗜铬细胞以及元嗜铬细胞分泌，在中枢神经内广泛分布，是中枢神经系统中极为重要的信息传递者。正常含量的儿茶酚胺在人体的神经系统和心血管系统等多种生理功能平衡中起着极其重要的调节作用，直接影响人体的代谢水平。某些代谢障碍会引起儿茶酚胺含量发生改变，从而导致重要疾病发生。例如重性抑郁症患者脑内NE含量明显增高，嗜铬细胞瘤患者血内NE水平升高。E对糖代谢有明显影响，应激引起交感神经-肾上腺髓质系统兴奋，E持续大量的释放，引起血糖升高。应激也可通过神经传导直接作用胰腺，抑制胰岛素的分泌。有研究发现慢性应激使大鼠血浆E含量升高。检测生物体内儿茶酚胺的浓度对上述严重疾病的临床诊断具有重要的参考价值。

吡咯并喹呤醌(PQQ)是一种氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，对N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）介导的兴奋性神经毒性具有调节作用。PQQ在神经精神疾病方面，具有较重要的研究前景。它具有较强的自由基清除功能。本研究室在前期研究中发现PQQ中的共轭醌键与氨基酸类神经递质中的氨基发生共轭反应而对神经递质的平衡具有潜在的调节功能。近来本课题组在抑郁症动物模型研究中采用PQQ干预后进行行为学评价发现一定剂量的PQQ对抑郁症具有明显的抑制作用。PQQ具有多个羧基的特殊化学结构，易与生物体内的多种活性物质发生反应；而儿茶酚胺结构中含有多个羟基活性基团。本发明拟通过体外研究PQQ与NE及 E 的反应，并通过测量慢性应激抑郁症模型鼠、以及给予一定剂量PQQ用药后脑内儿茶酚胺的含量变化，并通过UPLC-MS确证PQQ与NE发生反应生成PQQNE，探讨PQQ在抑郁症中对儿茶酚胺的调节作用，为研究PQQ在抑郁症神经保护方面的作用机制提供重要的研究价值，对疾病的诊断和预防治疗有重要意义。

越来越多的研究显示儿茶酚胺在疾病发生及进展过程中扮演了重要角色，科研工作者逐渐关注儿茶酚胺类物质的作用机制，这就需要提供快速精确的分析方法。目前报道的儿茶酚胺类物质的检测方法各种各样，其中主要以高效液相色谱方法为主，结合电化学、荧光或质谱检测器测定。这些方法各有优劣，比较常用的是高效液相色谱－电化学检测，但由于生物样本中干扰因素较多，而这些方法并不能彻底消除干扰，因而在临床应用中受到限制。

毛细管电泳方便快速，样品量少，具有高效灵敏的特点而受到广大分析工作者的重视。有文献报道毛细管电泳－间接电致化学发光检测尿中儿茶酚胺的含量，但每实验2 h必须更新电致化学发光溶液。另有文献报道采用异硫氰酸荧光素(FITC)对E和NE进行衍生，采用毛细管电泳加光纤发光二极管诱导荧光检测器测定尿中NE和E的含量，这些方法均需要特殊的检测器才能完成检测。

发明内容