[发明专利]毛细管电泳结合UPLC-MS分析PQQ对儿茶酚胺神经递质调节作用的研究方法

权利要求书

1.一种毛细管电泳结合UPLC-MS分析PQQ对儿茶酚胺神经递质调节作用的研究方法，其特征在于步骤为：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的42cm×50µm石英毛细管柱；新毛细管先依次用甲醇冲洗10min，去离子水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，去离子水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗15min；每次进样前，用去离子水及运行缓冲液各冲洗2min；

运行缓冲液及样品溶液均用0.22µm微孔针头过滤器过滤；运行缓冲液当日配制；运行缓冲液为：40mmol/L 四硼酸钠溶液，pH=9.0；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长是260nm，进样方式为压力进样20psi、5.0 s，分离电压为25kv，毛细管柱温25℃，二极管阵列PDA检测器检测；

UPLC-MS分析条件：UPLC型号 AcQuity H uplc＠,质谱检测器SQ Detector 2，柱子ACQUiTY UPLC＠BEH C18，色谱条件：流动相A：H₂O+0.1%TFA，B：CH₃OH，梯度洗脱，B/A体积比5/95为5min，75/25为25min，m/z：50-800，流速：0.3mL/min；

（3）缓冲体系和缓冲液浓度的选择

选择硼酸缓冲体系进行实验，分别配制四硼酸钠浓度为20、30、40、50、60 mmol/L进行试验，结果发现，选择40 mmol/L时基线平滑、分离度相对较好且有合适的保留时间；

（4）pH值的影响

选择40 mmol/L四硼酸钠缓冲溶液试验，结果发现当pH为 9.0时，峰型较好，分离效果也较好，因此，选择40 mmol/L、pH9.0的四硼酸钠缓冲溶液为合适；

（5）电压的选择

选择25kv较为理想；

（6）PQQ与NE、E反应液的分离检测及UPLC-MS鉴别

称取一定量的PQQ、NE及 E，分别用pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，配制成1mmoL·L^-1的PQQ、NE、E溶液；按摩尔比为1:1混合PQQ和NE得反应液A，PQQ和E混合得反应液B，PQQ与NE和E一起混合得反应液C；避光，于37℃水浴孵育24h；

PQQ与NE反应后产物PQQNE的质谱图显示M=481，482.22为M+1峰，483.36为M+2峰，464.24为M-OH峰；PQQNE分子量481，PQQ的羧基和NE的氨基去掉一份子水得到了酰胺；PQQ与E反应液只检测到PQQ的分子离子峰，未能检测到产物的分子离子峰；由于E分子结构上氨基上的氢被甲基取代，阻碍了其反应；

（7）生物样本处理

（7.1）脑组织样品处理

脑组织称重，每1mg脑组织加入7.5μL组织裂解液，匀浆，15000rpm/4℃离心15min，取上清液，再离心15min，得上清液，加入等体积的PCA沉淀剂，4℃冰浴放置10min后，再离心15min，所得脑组织液a备用；

组织裂解液为：1.2M K₂HPO₄+2M EDTA-2Na；

PCA沉淀剂为：0.1M高氯酸；

（7.2）固相萃取提取脑组织样品

SPE萃取小柱Generik PCX用1 mL甲醇活化，1mL去离子水平衡，将脑组织液a上样，用2mL去离子水，2mL甲醇冲洗，抽干，用1mL体积比4/96的甲酸/甲醇洗脱，N₂吹干，所得残渣用0.1%甲酸水溶液溶解后进行毛细管电泳分析及UPLC-MS分析；

（8）标准曲线制备

准确吸取NE、E储备液，用空白脑组织液a分别配成NE浓度为0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μmoL·L^-1系列含药脑组织液；E浓度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5μmoL·L^-1系列含药脑组织液，与空白脑组织液a分别以（7.2）方法处理后进样分析，所得NE、E峰面积扣除相应的空白脑组织液a峰面积为纵坐标Y，NE、E的浓度X为横坐标，进行回归分析，得NE的回归方程为Y= 6250315X + 4672.8，R² = 0.9998，线性范围0.02~62.5μmoL·L^-1；得E 的回归方程为Y= 862932X + 2036.2，R² = 0.9996，线性范围0.1~312.5μmoL·L^-1；NE检出限为0.1nmoL·L^-1，E检出限为 0.2 nmoL·L^-1，S／N=3；迁移时间和峰面积的相对标准偏差RSD分别小于0.68％及1.06％；

（9）回收率及精密度测定

（9.1）提取回收率测定

取经处理后的空白脑组织液a，精确配制同时含NE和E，浓度分别为0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含药脑组织液各5份，按（7.2）方法处理后进行毛细管电泳分析，

含药脑组织液经过固相萃取所得的峰面积与相应浓度未经固相萃取提取的标准液直接进样所得的峰面积比值计算得到提取回收率；

（9.2）方法回收率：精确配制同时含NE和E，浓度分别为0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含药脑组织液各5份，按上述（7.2）方法处理后分析，用标准曲线计算出NE及 E的浓度，与理论浓度比值计算得到方法回收率；

（9.3）精密度试验

精确配制同时含NE和E，高、中、低3种浓度分别为0.5、5.0、50μmoL·L^-1的含药脑组织液各5份，按上述（7.2）方法处理后在确定的色谱条件下于同一天内连续进样5次，根据峰面积计算精确度。