[发明专利]鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用有效
| 申请号： | 201611002289.6 | 申请日： | 2016-11-14 |
| 公开（公告）号： | CN106755031B | 公开（公告）日： | 2020-04-17 |
| 发明（设计）人： | 杜瑾;张爱君;姜天翔;郝建安;王静 | 申请（专利权）人： | 自然资源部天津海水淡化与综合利用研究所 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津市三利专利商标代理有限公司 12107 | 代理人： | 李蕊 |
| 地址： | 300000*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 糖脂 生产 质粒 及其 构建 方法 大肠杆菌 工程 应用 | ||
1.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ202，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。
3.由权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。
4.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ208，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。
6.由权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。
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