[发明专利]一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种主要花色苷的方法

权利要求书

1.一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

(1).匀浆破碎偶合酶水解黑加仑果渣：将黑加仑果渣加入质量体积比5～9倍的水进行匀浆破碎，将得到黑加仑果渣浆按质量比20～60mg/g加入纤维素酶、果胶酶或上述两种酶的混合酶，放入恒温摇床中进行酶解，抽滤，收集滤液滤渣；

(2).负压空化强化提取黑加仑滤渣：将得到的黑加仑滤渣用乙醇溶液进行负压空化强化提取，乙醇浓度为70-90％，负压空化提取压力为-0.04～-0.09MPa，室温下提取2-4次，提取时间为30～50min，提取结束后进行抽滤，将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收除去溶剂，得到黑加仑浸膏；

(3).大孔吸附树脂富集黑加仑花色苷：将得到的浸膏加入适量的水溶解进行离心，将得到的上清液加入D4020、AB-8、NKA-9、D3520、D101和DM-130大孔吸附树脂柱中的一种，进行吸附富集，然后用蒸馏水进行非目标化合物的洗脱，弃去蒸馏水洗脱液，再用20～50％乙醇洗脱，收集洗脱液；减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷树脂富集物；

(4).中压快闪反相色谱分离花色苷单体：步骤(3)得到的富集物用一定比例水，甲醇，甲酸溶液刚好溶解后上ODS-C₁₈反相硅胶中压柱，选用流动相A-水:甲酸(90:10)，流动相B-乙腈：甲醇(85:15)，A:B＝93:7进行等梯度洗脱，洗脱流速为20～35mL/min，收集相应的洗脱液得到相应的花色苷单体；

(5).低温晶析和重结晶黑加仑花色苷：将得到的花色苷成分经过低温晶析和重结晶得到纯度可达95％的花色苷单体成分，分别为飞燕草素3-O-葡萄糖苷、飞燕草素3-O-芸香糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香糖苷。

2.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于加入按质量体积比5～9倍原材料的水进行匀浆破碎，连续匀浆破碎三次，每次4～9分钟，将匀浆破碎后得到的浆液用柠檬酸或盐酸将PH值调节到3～6，将得到黑加仑果渣浆按质量比20～60mg/g加入纤维素酶、果胶酶或上述两种酶的混合酶，然后将浆液放入恒温摇床中，在温度20～50℃酶解1～5h，抽滤，收集滤液滤渣。

3.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于将上一步骤中的滤渣按质量体积比10～30倍的滤渣质量的乙醇进行负压空化提取，乙醇浓度为70-90％，负压空化提取压力为-0.04～-0.09MPa，室温下提取2～4次，提取时间为30～50min,将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收除去溶剂，得到黑加仑浸膏。

4.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于选用大孔吸附树脂型号为D4020、AB-8、NKA-9、D3520、D101和DM-130树脂中的一种，上述黑加仑浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的纯水中后，离心取上层清液上样加入大孔吸附树脂柱，上样体积为1～10倍柱体积，吸附饱和后用蒸馏水洗脱杂质至流出液无色，然后用20～50％乙醇洗脱，收集洗脱溶液，减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷树脂富集物。

5.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于将黑加仑花色苷树脂富集物加入初始流动相溶解后进行0.45μm过滤上样，中压层析柱填料为ODS-C₁₈反相硅胶，上样体积为柱体积的1/10～1/5，选用流动相A-水：甲酸(90：10)，流动相B-乙腈：甲醇(85：15)，A：B＝93：7等梯度洗脱，洗脱流速为20～35mL/min，用HPLC在检测波长520nm检测流出物成分，合并相同部分。

6.按照权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于其低温晶析和重结晶所用溶剂为50～70％乙醇，用溶剂饱和溶解中压柱层析得到的花色苷单体组分，然后进行低温晶析和重结晶，晶析温度为-4～20℃。