[发明专利]基于纳米金‑DNA复合材料检测蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金-DNA复合材料检测蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质的检测为多种疾病的早期诊断提供了非常有价值的信息，如低白蛋白血症，老年痴呆症、癌症、前列腺炎症、艾滋病等(U.Andreasson；E.Portelius；M.E.Andersson,et al.,Biomarker Med.2007,1,59-78；V.U.Bai；A.Kaseb；S.Tejwani,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2007,104,2343-2348；J.Hardy；D.J.Selkoe,Science 2002,297,353-356)。目前针对蛋白质的检测方法主要包括两大类：一种是高效液相色谱质谱联用法和二维凝胶电泳法。该方法存在需要专业人员操作、仪器昂贵、耗时长的缺点。另一种是基于抗原-抗体特异性识别生物标记物的免疫方法。该方法不仅操作复杂、工作量大、抗原和抗体必须来自于生物活体，导致经济成本极高，而且它们的种类有限。这两种方法均难以实现蛋白质高通量的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米金-DNA复合材料检测蛋白质的方法。

为了实现本发明目的，本发明的基于纳米金-DNA复合材料检测蛋白质的方法，包括以下步骤：

S1、纳米金颗粒的制备：通过柠檬酸钠还原氯金酸制得，氯金酸溶液浓度为50mM，氯金酸和柠檬酸钠的摩尔比为3.5-3.8:1(优选3.5:1)，所得溶液中纳米金颗粒的平均粒径约为13-18nm(优选13nm)；

S2、纳米金-DNA复合物的制备：向上述含有纳米金颗粒的溶液50μL中加入浓度为1μM的一端修饰有巯基的DNA溶液10μL，所述DNA为poly(A)₁₅，得到纳米金-poly(A)₁₅复合物；

S3、纳米金-DNA-蛋白质三元复合物的生成：向上述含有纳米金-DNA复合物的溶液60μL中分别加入M1浓度的11种蛋白质溶液各50μL，于37℃孵育30min；同时以ddH₂O为空白对照，即向上述含有纳米金-DNA复合物的溶液60μL中加入ddH₂O 50μL，于37℃孵育30min；

其中，所述11种蛋白质包括胰蛋白酶(Try)、牛血红蛋白(Hem)、牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、胃蛋白酶(Pep)、木瓜蛋白酶(Pap)、辣根过氧化酶(HRP)、软铁蛋白(TRF)、细胞色素-C(Cyt-C)、纤维原蛋白(Fib)和刀豆球蛋白(Con)；

S4、纳米金催化硝基苯酚和硼氢化钠反应生成氨基苯酚：向S3所得溶液110μL中加入浓度为5mM的硝基苯酚溶液200μL和浓度为0.6M的硼氢化钠溶液200μL，利用裸露的纳米金表面催化其反应；

S5、目测观察溶液由黄色变成无色的反应时间，即CCT值(Color Change Time)，分别记下不同蛋白质对应的CCT值，以及空白对照ddH₂O对应的CCT₀值，并分别计算不同蛋白质对应的CCT/CCT₀值，绘制表格；

S6、将所述DNA替换为poly(C)₁₅，重复S1～S5；

S7、将所述DNA替换为poly(T)₁₅，重复S1～S5；

S8、将针对上述三种DNA绘制的反应不同蛋白质CCT/CCT₀值的表格输入软件IBM SPSS Statistics 19(参数设置为默认)，从而得到不同蛋白质对应的LDA图；

S9、按照S1和S2分别制备针对上述三种DNA的纳米金-DNA复合物溶液，分别向三种纳米金-DNA复合物溶液60μL中加入M1浓度的待测蛋白质溶液50μL，于37℃孵育30min；同时以ddH₂O为空白对照；

S10、向S9所得溶液110μL中加入浓度为5mM的硝基苯酚溶液200μL和浓度为0.6M的硼氢化钠溶液200μL，进行反应；目测观察溶液由黄色变成无色的反应时间，并计算CCT/CCT₀值，代入S8所述软件中，根据LDA图显示结果，对待测蛋白质进行识别。

前述的方法，S3中每种蛋白质做5～6个重复。

前述的方法，S3和S9中，300nM≤M1≤2000μM。优选的，M1为300nM或500nM(即三元复合物溶液中蛋白质的终浓度为30nM或50nM)。